162857. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új, lassú hatású alfa- és béta-glükopropteidek előállítására mikróba-tartalmú oldatokból vagy szuszpenziókból

162857 •6 gyengén opaleszkáló oldatot adnak, melyből forralásnál nem csapódnak ki. E glükoproteidek jól oldhatók perklórsavban és triíklórecetsavban. E savakkal képezett oldatokból a glükop<roteideket tisztán, denaturálás nélkül ki lehet nyerni, pH = 2,10-nél. Egyébként a glükoproteidek jól definiálhatók gyulladást gátló hatásuk intenzitásával is, melyet egy sztenderd anyaggal való összehasonlítással vizsgálhatunk. A gyulladást (ödémát) kísérleti úton karrageninnel válthatjuk ki. A gyulladást csökkentő hatás erőssége egyenesen arányos a glükoproteid frakció tisztaságával. Egyébként lehetséges az is, hogy e glükoproteidekben egy speciális metilpentóz, ná/szerint a fukóz is megtalálható. A találmány tárgyát e glükoproteidek előállítási eljárása képezi. Az eljárás során először is szilárd vagy folyékony táplalajon a kiválasztott mikroba-fajtából tenyészetet készítünk. E mikrobák lehetnek Pneumococcus-ok, Streptoeoecus-ok, Microooccus-ok, Neisseriá-k, Staphyloooeaus-ok, Klebsellia pneumoniae-k, Haemophilus influenzae-k és egy telepen belül kéit vagy többfajta mikroba is található. A mikróba-telep teljes kifejlődése után a különböző tenyészeteket „learatjuk". Összegyűjtjük a tenyészeteket, a mikrobákat vizes közegben szuszpendáljuk és belőlük vegyi, fizikai és/vagy enzimatikus módszerekkel oldatot készítünk. Oldás után a sejtmaradványokat elkülönítjük, a tiszta oldatot szárazra pároljuk, a maradékot egy vagy több zsíroldó oldószerrel extraháljuk, a lipoidmentes maradékot vizes oldószerrel újra felvesszük, a zavaró fehérjéket kémiai vagy fizikai módszerekkel kicsapjuk, a kivált fehérjéket elkülönítjük, és a tiszta vizes oldatból frakcionáltan kicsapjuk a fehérjementes glükooroteidéket. A frakcionált kicsapás vízben oldódó oldószer, vagy oldószer-keverékek hozzáadásával történik. A kivált glükoproteideket, ha szükséges, még tovább frakcionálhatjuk szelektív hordozókra való felvitellel. A glükoproteideket szolgáltató mikróbaJkultúrák kitenyésztése történhet szilárd vagy folyékony táptalajon, így pl. Petri-csészében étkezési zselatinon, melyet esetleg más tápanyagokkal is felerősítenek, történhet rázókészülékbe helyezett kultivátorokban, vagy ipari méretű fermentorokban (az utóbbiaknál folyékony táptalajt használnak). .**''•• Amint a mikróba-telep teljesen kifejlődött, megtörténik összegyűjtésük. A mikroba-anyagot szuszpendáljuk vízben, melyhez esetleg pufferanyagot is adtunk. Ilyen pufferoló anyag pl. a dinátriumfoszfát. A szuszpendáló oldathoz fertőtlenítő anyagot is szokás adni, pl. tiiomerzált. A szuszDenzióban lévő baktériumok mennyiségét fotómetrikus úton lehet meghatározni. A baktérium-szuszpenzió koncentrációját egy tetszőlegesen megválasztott, de azonos értéken tartott baktérium-mennyiségre állítják be. A baktérium-szuBzpenziót ezután feloldják. A mikrobák (baktériumok) testének feloldása különböző módszerekkel lehetséges, pl. vegyi anyagok hozzáadásával, melyek általában felületaktív és antiszeptikus hatású anyagokat tar-5 talmaznak, ilyen pl. a polietilénglikol szorbinsavas észtere; történhet az oldás fizikai úton, pl. melegítéssel, ultrahanggal vagy erős besugárzással; történhet az oldás enzimes úton, pl. proteolitikus vagy polimukoszaoharolitikus hátaid sú enzimek hozzáadásával, vagy bármely egyéb módon, mellyel a mikróbasejtek tartalma lehetőleg denaturálódás nélkül és a lehető legnagyobb mértékben kinyerhető. 15 A mikróba-teatek feloldását végezhetjük több. eljárás kombinálásával is. Vegyes oldási eljárásnál pl. egymást követően először fehérjeoldó enzimekkel dolgozunk, ilyen pl. a tripszin, papain, bromelain, az alfa-kimotripszin vagy a 20 pronáz, utána esetleg polimukoszaoharolitikus enzimet használunk, ilyen pl. a lázozim, vagy a hialuronidáz, az oldást ezután vegyi és antiszeDtikus hatású »anyagok hozzáadásával folytatjuk, ilyenek pl. a szerves higanyvegyületek, 25 triklórecetsav, fitinsav vagy a perklórsiav. A tripszin helyett használhatunk pankreatint, sztreptokinázt vagy sztreptodomázt is. A mikrobák feloldódásának előrehaladását fc-30 tómetrikus úton követni tudjuk. Ha a feloldódás elért egy megfelelő fokot, az oldathoz konzerváló és/vagy stabilizáló anyagot adunk. Az így előállított baktérium-oldatok zavaros, adott ^esetben pufferolt vizes készít-33 menyek, melyek fenekén a baktériumtestekből származó üledék van. Áz üledéket a szokott módszerekkel távolítjuk el, szűréssel vagy centrifugálással. Az üledéktől megszabadított baktérium-oldat-40 ból történik ezután a glükoproteidek előállítása (ez képezi a találmány tárgyát). A glükoproteidek kivonásának céljából az oldatot bepárlással vagy liofilizálással víztelenítjük. Az így kapott száraz maradékból kivonjuk a lipoidokat 45 egy vagy több zsíroldó-oldószer alkalmazásával, pl. éterrel, acetonnal vagy acetaldehid és metanol keverékével. A lipoidok extrahálását esetleg többször is meg kell ismételni. A lipoidmentes maradékot, mely száraz por, víz hozzá-50 adásával újra oldatba visszük. A lipoidmentesítés történhet két lépésben is. Az első műveletnél a baktérium-oldatot acetaldehid és metanol keverékével extraháljuk, mely a' lipoidok nagy részét feloldja, így a foszfoli-55 poidokat és a liooproteideket is. A glükoproteid-frakció az előzőekkel ellentétben nem oldódik a keverékben és ezért azoktól jól elválasztható. Ezután egy második műveletben oxigéntar-60 talmú oldószerrel extrahálunk, melyet visszafolyató hűtővel felszerelt készülékben forralunk, míg az aktív frakció teljesen lipoidmentes nem lesz. Az ily módon elkülönített glükoproteidfrakció még szennyezve van többé vagy ke-65 vésbé denaturált proteidekkel és ásványi sókkal. 3