162835. lajstromszámú szabadalom • Vacina csirkék marek-féle megbetegedéssel szembeni immunizálására

162835 3 A találmány szerint egyréteges sejttenyésze-, tet ATCC vírustörzzsel oltunk be. Ezt a vírust Avian Herpesvirus IV-nek (AHIV), vagy másképp pulyka-herpesvírusnak (PHV) nevezzük. A beoltott sejttenyészeteket (pl. csirkeveséből, 5 csirkeembrió-kötószövetből vagy kacsaembriókötőszövetből származó tenyészeteket) addig in» kubáljük, amíg a sejtek legnagyobb része megfertőződik a vírussal. A sejteket eltávolítjuk a tenyészetből, tripszinnel kezeljük, és friss egy- '° réteges sejttenyészetre helyezzük. A fenti eljárással a vírust sorozatos sejttenyésztésnek vetjük alá addig, • amíg megfelelő mennyiségű vírusssal megfertőzött sejtet kapunk. Az utolsó tenyésztésben kapott sejteket tripszinnal disz- 15 pergáljuk, elkülönítjük a tenyésztési közegtől, 5—10% dimetilszulfoxidot tartalmazó tenyésztési közegben diszpergáljuk, és a diszperzió víruskoncentrációját kb. 10"'—-107 FKE/ml értékre állítjuk be. A pulykából kivont vírussal fertő- 20 zött sejteket, amelyeket az első tenyészet beoltásához használtunk, az álllatok heparinnal kezelt teljes véréből, vagy az állatok veseszöveteiből különítjük el. A veseszöveteket a fertőzött sejtek elkülönítése előtt foszpátp'.'ffert tar- 25 talmazó sóoldattal mossuk, és tripszinnel diszpergáljuk. A fenti módon előállított vakcina további fel- 30 dolgozása során Úgy járunk el, hogy a tenyésztési közegben szuszpendált, vírussal megfertőzött sejteket elroncsoljuk, és az elroncsolt sejteket eltávolítjuk a közegből. Így lényegében élő, legyengített, sejtmentes vírusokat tartalmazó 35 anyagot kapunk. A fenti eljárással előállított vakcinákat 1—21 napos csirkéknek beadva az állatokat bizton- 40 sággal immunizálhatjuk a Marek-féle megbetegedéssel szemben. A találmány szerinti eljárást a következők- 45 ben részletesen ismertetjük. 1. táblázat A vakcina előállításához felhasznált Avian Herpesvirus IV-t (AHIV) fertőzött pulykák véréből és veseszöveteiből különítettük el. Az FC126 jelzésű izolátumokat Indiában tenyésztett két 23 hetes pulykából különítettük el. A további izolátumok eredete a következő: AC16: 16 hetes pulyka (Georgia) vére; AC18: 18 hetes pulyka (Indiana) veseszövetei; WTHV1: pulyka (Wisconsin) veseszövetei. A szerológiai vizsgálatok, az agar-gél-preciptin próba (AGP), a vírussemlegesítési vizsgálat (VN) és a fluoreszcens antitest-vizsgálat (FA) alapján megállapítottuk. hogy a négy AHIV izolátum antigén-szempontból nem különböztethető meg egymástól, azonban egyik sem azonos a Marek-féle megbetegedést okozó herpesvírussal (MBHV). A vizsgálatok eredményeit az 1. táblázatban közöljük. Antigén*2

' Szérum*1

' FC126 MBHV Kontroll AGPVN<4

> FA AGP FA AGP és FA<3

> Hdperimmunis: FC1 26 ícs) + + ++ — + — AC16<cs) + + + — + — AC1 8 (cs) + + ++ — + — WTHVI (cs) + + ++ — + — Normál sejtek (cs) — — — — — — Gyógyuló: FC1 26 (cs) + + + + + — FC126(p) + — ND — ND — MB—JM (cs)<5

) + _|_ _|_ ++ ++ — MB—GA (cs)(r>

) + + + ++ ++ — MB— —RPL—39 (cs)<5

> + + + ++ ++ — MB—FC1 27 (cs)<5

> Tc f\r\ 1"r*/"v11 * + - + ' ++ ++ — -IVUXILI LM.1. Beoltatlan (CS) Beoltatlan (P) — — ND — ND ' — Megjegyzések: (•') A szérumot az antigén-immunizálás alapján azonosítottuk. A zárójelben levő betűk a szérum eredetét jelölik; cs = csirke; p = pulyka. (2

) Az AGP és FA reakciókat az intenzitás szerint osztályoztuk. -\~\- (intenzív), + (érzékelhető, de kevésbé intenzív), — (negatív); (3

) Az FA-reakciókat a vírusfoltok közötti sejtek megfestődésének elmaradásával kontrolláltuk ; ND = nem értékelhető. (4

) A vírus-semlegesítést 50%-os foltcsökkenésnél tekintjük pozitívnak 1 : 20-as végső szérumhígítás esetén. (5

) Négy külön MBHV törzs. A herpesvirus egyik jellemző tulajdonsága az, hogy a vírussal megfertőzött sejttenyészetekben 50 elkülönült fertőzési gócok jelennek meg, amelyek kifejlődött formában lekerekített, merev, pusztuló sejtrögökből állnak. Az AHIV által előidézett fenti típusú rögök ill. foltok mind a négy izolátum esetén morfológiailag eltérnek az 55 MBHV által előidézettektől. A pulykákból egyéb módon is elkülöníthetjük a vírust, azonban előnyösen az állatok véréből és vese-sejtjeiből indulunk ki; ezek 60 ugyanis nagymennyiségű vírust tartalmaznak és könnyen elkülöníthetők. A vírus elszaporítására standard egyrétegű sejttenyészeteket, pl. csirkevesét, csirke-embrió-kötőszövetet és kacsaembrió-kötőszövetet használunk [Witter és 63 mtsai: Avian Diseases 13, 101—118 (1969)], 2