162292. lajstromszámú szabadalom • Eljárás proteolitikus enzimek előállítására
13 162292 14 mennyiséget jelenti, mely 10,l-es pH-n, 25 C hőmérsékleten 10 perc reakcióidő alatt annvi hemoglobint bont le. hogy a lebontási termékek fenil-reagenssel adott szine megegyezik az 1 mg-ekvivalens tirozinnal képzett színnel. A reakció kezdeti sebességének olyannak kell lennie, hogy a percénként 5 képződő hasadási termék triklórecetsawal ne képezzen csapadékot. Azt tapasztaltuk, hogy karbamid jelenlétében valamennyi enzim 10-es vagy annál nagyobb pH-értéken fejti ki hemoglobinnal szembeni optimális proteolitikus aktivitását. 10 A találmány tárgya eljárás a szerin-sorozatba tartozó új proteolitikus enzimek előállítására, amelyek hemoglobinnal szembeni optimális proteolitikus aktivitásukat karbamid jelenlétében legalább 10-es pH-értéken fejtik ki, a megfelelő baktériumtörzsek asszimilálható szén- és nitrogénforrást 15 tartalmazó táptalajon végzett aerob tenyésztése útján. A találmány értelmében a tenyésztéshez baktériumként a Bacillus nemzetségnek a természetből 9 és 11 közötti pH-értékű táptalajokon elkülönített proteáz-termelő fajait használjuk fel, és a táptalaj pH-ját a tenyésztés fó'szakaszaban 20 7,5 és 10,5 közötti értéken tartjuk. A tenyésztés végén a proteolitikus enzimeket önmagában ismert módon elkülönítjük a táptalajtól. A tenyésztési közeget önmagában ismert alapelvek szerint állítjuk össze. Asszimilálható szénforrásként szénhidrátokat 26 alkalmazhatunk, így szacharózt, glükózt, keményítőt, gabonalisztet, malátát, rizst, cirokot stb. A szénhidrát-koncentráció elég tág határok közt változhat; , minimálisan 1%-ot, maximálisan 25%-ot használhatunk, azonban az általános gyakorlatnak megfelelően a 8-10%-os 30 koncentráció a legelőnyösebb. (A százalékok dextrózra vannak számolva.) Azt találtuk, hogy tenyésztési közeg jelenlétében a szénhidrátok a savas komponensek mennyiségét növelik, ami abból látható, hogy a tenyésztés során a közeg pH-ja csökken. Mivel igen lényeges, hogy a 35 tenyésztési közeg pH-ját a tenyésztés fó'periódusában 7,5 és 10,5 között tartsuk, gondoskodnunk kell róla, hogy a közeg pH-ja ez idő alatt ne csökkenjen huzamosabban 7 alá. Hogy a pH-t a kívánt tartományban tartsuk, a tenyésztéshez csak korlátozott mennyiségű szénhidrátot alkalmazunk, s e mellett 40 még valamely olyan pufferanyagot is használunk, amely a pH-t a kívánt határok közt tartja. Azt találtuk, hogy a tenyésztési közegbe legfeljebb 0,2 mólos koncentrációban, adagolt karbonátokkal, különösen pedig szeszkvikarbonátokkal 10,5-ös, ill. 9.3-as pH-t állíthatunk elő. 46 Használhatunk azonban más pufferrendszereket is, így pl. foszfátpuffereket. Megtehetjük azt is, hogy a tenyésztést kismennyiségű szénhidrát jelenlétében kezdjük, s a szénhidrátot kis részletekben fokozatosan adagoljuk a tenyésztés folyamán. 80 A tenyésztés megvalósításának az a harmadik lehetősége, hogy a pH-t különböző e célra használatos lúgos kémhatású anyagok segítségével automatikusan szabályozzuk. pH-szabályozó anyagként a karbonátokat és szeszkvikarbonátokat igen jól használhatjuk. Meglepő, hogy ezeket az •* anyagokat a tenyésztés folyamán a fent ismertetett koncentrációban alkalmazhatjuk. A tenyésztési közeg nitrogénforrása szerves vagy szervetlen lehet. A nitrátok és ammóniumsók sok esetben alkalmazhatóak megfelelő nitrogénforrásként. A szerves °0 nitrogénforrások között sok olyan anyag van, melyet ismert módon alkalmaznak baktériumtenyészetek nitrogénforrásául. Ilyen anyagok pl. az alábbiak: szójaliszt, gyapotmag-liszt, földimogyoró-liszt, kazein, kukoricalekvár, élesztőextraktumok, karbamid, albumin, stb. •* A tenyésztési közegnek természetesen tartalmaznia kell a > szokványos nyomnyi mennyiségben jelenlevő anyagokat is. A tenyésztés hőmérséklete rendszerint megegyezik az ismert Bacillus-törzsek ismert tenyésztésénél alkalmazott hőmérséklettel. Általában 25-55 C° közti hőmérsékleten végezzük a tenyésztést. Célszerűen 30-40 C° közötti hőmérsékletet alkalmazunk. Mivel a tenyésztést aerob körülmények között kell megvalósítani, ha fermentorokat használunk, mesterséges levegőztetést kell alkalmaznunk. A levegó'arány hasonló az ismert tenyésztési folyamatokban használt levegó'arány hoz. A maximális proteolitikus enzim-termelést általában 1-5 napos tenyésztési idő után kaphatjuk. Ámbár a II. táblázatban felsorolt fajokkal és törzsekkel proteolitikus enzimtermelésre vonatkozó kísérleteket többnyire rázóedényekben vagy kísérleti üzemi méretű fermentorokban végeztük, felületi tenyésztést is végeztünk. Felületi tenyésztés esetén a tenyésztési közeg 10 g buzakorpából, 2 g Na3PO f . 12H 2 0-ból éskb. 10 ml vízből állt. Az inokuláció előtt a pH-t 2 ml In NaOH-val kb. 10-re állítottuk be. Ezen a közegen a C 300 és C 303-as törzseket tenyésztettük felületi tenyésztési módszerrel. A két törzs proteolitikus enzimtermelése pH 10-en kb. 20 Ansonegység/kg buzakorpa volt. A II. táblázatban felsorolt fajok és törzsek tenyésztésére az alábbi két közeget használtuk: 1. a BPFA jelű közeg összetétele: g anyag/liter csapvíz t Burgonyaliszt 50 Szacharóz 50 Árpaliszt 50 Szójabab-liszt 50 Nátrium-kazeinát 10 Na2 HP0 4 .12H 2 0 9 Pluronic, 0,1 2. a BSX jelű közeg összetétele: 6 anyag/liter csapvíz Árpaliszt 100 Szójabab-liszt 30 Pluronic 0,1 Mindkét közeget steril körülmények között nátrium-szeszkvikarbonáttal vagy nátriumkarbonáttal a kívánt pH-ra állítottuk. Sterilezés előtt a közegben levő keményítőt a-amilázzal folyósítottuk. A razoedényben végzett kísérleteket 500 ml-es razóedényb'en végeztük. Mindegyik edény 100 ml BPFA vagy BSX tenyésztési közeget tartalmazott. A közegeket felhasználás előtt 90 percig 120 C°-os autoklávban sterileztük, majd a sterilezés után 9,3 - 10,5 pH-ra állítottuk nátrium-szeszkvikarbonát segítségével. Minden baktérium-mintát négy edényben tenyésztettünk. Az Anson-egységben kifejezett enzimtartalom meghatározására a tenyésztés kezdetétől számított 3, 4, 5 és 6. napon vettünk mintát. Az edényeket a tenyésztés idejére egy 240 ford/perc sebességű forgóasztalra helyeztük. Az alábbi táblázatban (IV. táblázat) a különböző törzsek maximális enzimtermelését és a közegnek a maximális enzimtermeléskor észlelhető pH-iát tüntettük fel. 7
