162136. lajstromszámú szabadalom • Eljárás L-aszparagináz tisztítására

162136 3 4 marcescens-ből elkülönített L-aszparagináz-oldaitot, hogy az Escherichia coli vagy a Serratia marcescens sejtjeit előzetesen enzimatikus oldásnak vetjük alá Iizozim ós ko'mplexképző anyag együttes hatásával, az így felszabadított nukleinsavakat >mangán4dorid vaigy sztreptomicin^szulfát hozzáadásával elkülönítjük, az így kapott lizátum oldatát 50—60 C°-ra való melegítéssel protein-mentesítjük, a csapadékot elkülönítjük, ammónium-'szulfát-oldatot adunk hozzá, a képződött csapadékot elkülönítjük, majd ismét ammóniumszulfát-oldatot adunk hozzá, az elkülönített csapadékot puffer-oldattal fölvesszük, majd ammóniumszulfát-oldat segítségével ismét kicsapjuk, a képződött csapadékot elkülönítjük, puffer-oldattal oldatba visszük, és az oldatot anioncserélőn, majd hidroxi-apatiton kromatografáljuk. A találmány szerinti eljárás új vonása, hogy az így kapott nyers L-aszparagináz-oldatból az enzimet glicerin és etilalkohol hozzáadásával csapjuk ki. A találmány szerinti eljárás során az L-aszparagináz lassan és fokozatosan csapódik ki az oldatból; ez kedvezően hat az enzim tisztaságára és a kristályképződésre. A találmány szerinti tisztítási eljárást 0 C° és 25 C° közötti hőmérsékleten valósíthatjuk meg. A találmány szerinti eljárásban alkalmazott glicerin-etilalkohol elegy célszerűen 1—3 rész glicerint tartalmaz 5 rész etilalkoholra vonatkoztatva. A találmány egy célszerű foganatosítási módja szerint 1,5—2 rész glicerint használunk 5 rész etilalkoholra vonatkoztatva. Az eljárást előnyösen úgy valósítjuk meg, hogy a szerves oldatokat két részletben adjuk az enzim-oldathoz; először a glicerint, azután az etilalkoholt. A kiindulási anyagként használt vizes L-aszparagináz-oldatot bármely ismert eljárással előállíthatjuk. A találmány szerinti tisztítási eljárást mind nagy, mind pedig kis enzim^aktivitású L^aszparagiház-oldatokkal megvalósíthatjuk. Abban az esetben, ha híg enzim-oldattal dolgozunk, a találmány szerinti eljárást többször megismételhetjük. A találmány szerinti eljárás foganatosítására az alábbi kiviteli példákat isimertetjük. A példákban kiindulási anyagként használt nyers enzim-oldatot az alábbi módszerrel állítjuk elő: 4% élesztő-kivonatot tartalmazó és nátriumhidroxid hozzáadásával kb. 7,4-es pH-ra beállított táptalajon 32 C°-on aerob körülmiények között Escherichia coli ATCC 11 303 jelű törzsét tenyésztjük. Huszonnégy óra tenyésztés után maximális baktérium-sűrűséget kapunk. Ekkor a tenyészoldatot 4 C°-ra hűtjük és a sejteket centrifugálással elkülönítjük. A sejtmasszát 4 C°-on puffer-oldattal mossuk, majd homogenizáljuk, és így az Escherichia coli sejtszuszpenzióját kapjuk, amelyet a tisztítási művelet kiindulási anyagaként használunk. A példákban használt NE (nemzetközi egység) jelölés olyan enzim-mennyiségre vonatkozik, amely 37 C° hőmérsékleten egy perc alatt 1 mikromól ammóniát szabadít fel. 1785 NE L-aszparaginázt és 19 mg proteint (specifikus aktivitás 94 Ne/mg) tartalmazó nyers L-aszparagináz 5 ml vízben készített oldatához 0 C° és 5 C° között keverés közben hozzáadunk 1,5 ml glicerint, majd 5 ml etilalkoholt. Az elegyet a fenti hőmérsékleten tovább 2,5 15 órán keresztül keverjük, majd a kivált csapadékot centrifugálással elkülönítjük. A csapadékot vízben történt oldás után elemezzük. A fenti eljárással 1400 NE L-aszparaginázt és 11 mg proteint (specifikus aktivitás: 127 NE/mg) 20 állítottunk elő. Hozam: 78,5%. 2. példa 25 5255 NE L-aszparagináz és 40,8 mg proteint (specifikus aktivitás 128,5 NE/mg) tartalmazó nyers L-aszparagináz 5 ml vízzel készített oldatát jégfürdőn lehűtjük, majd keverés közben 2 ml glicerint és 5 ml etanolt adunk hozzá. Az 30 elegyet az adagolás befejezte után további 5 percig keverjük, majd éjszakán át 0—5 C°-on tartjuk. A csapadékot centrifugálással különítjük el, majd elemzés céljára vízben oldjuk. Az így előállított oldat 5100 NE L-aszparaginázt ós 23,2 35 mg proteint (specifikus aktivitás: 220 NE/mg) tartalmaz. Hozam: 97,2%. 3. példa 40 A 2. példában megadott (anyagokból kiindulva, a példában isimertetett eljárást 20 C°-on megvalósítva finom tűkben kristályosodó terméket állítottunk elő. A termék 5130 NE L-^aszparagi-45 názt és 24,8 mg proteint (specifikus aktivitás: 207 NE/mg) tartalmaz. Hozam: 97,7%. Szabadalmi igénypontok: 50 1. Eljárás Escherichia coli-ból vagy Serratai marcescens-ből elkülönített L-aiszparagináz tisztítására, aihol az Escherichia coli vagy a Serratia marcescens sejtjeit előzetesen enzimatikus ol-55 dásnak vetjük alá Iizozim és kotmplexképző anyag együttes hatásával, az így felszabadított nukleinsavakat mangánklorid vagy sztreptomicinszulfát hozzáadásával elkülönítjük, az így kapott nyers lizátum oldatát 50—60 C°-ra való me-60 legítéssel protein-mentesítjük, a csapadékot elkülönítjük, ammóniumszulfát^oldatot adunk hozzá, a képződött csapadékot elkülönítjük, majd ismét ammóniumszulfát-oldatot adunk hozzá, az elkülönített csapadékot puffer-oldattal 65 fölvesszük, majd ammóniumszulfát-oldat segít-15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 5 1. példa 2