162135. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a polimixinekből származó ciklusos polipeptidek előállítására
162135 Ugyanis lehetetlen az enzimhatásra felszabadult aminfunkciót szelektíven reagáltatni. A találmány értelmében a III általános képletű polimixinek polipeptid gyűrűjének aminfunkciói II általános képletű védőcsoportok segítségével blokkolhatok. Az ilyen védőcsoportoknak nemcsak az az előnye, hogy jó hozammal kapcsolhatók a védeni kívánt aminfunkciókhoz, hanem az is, hogy olyan polimixinekhez jutunk, amelyeknek az eredetileg szabad aminfunkciói blokkolva vannak, és a vegyületek vizes közegben oldhatók, ami lehetővé teszi az enzimatikus reakciók végrehajtását olyan pH-nál, hőmérsékleten és annyi ideig, hogy az alkalmazott enzim hatására az oldallánc és a polipeptid gyűrű közti peptidkötés specifikusan felszakad anélkül, hogy a polimixki polipeptid gyűrűje kárt szenvedne. Az ilyen védőcsoportok azután könnyen eltávolíthatók a polipeptid gyűrű felszakítása nélkül, például hidrogenolizisisel. Az ilyen védőcsoportok a gyűrűben okozott változások ellenére nem akadályozzák az enzim hatását. A találmány értelmében az I általános képletű termékek a IV általános képletű vegyületekből állíthatók elő — ebben a képletben G, K, X és Y—Z a fenti jelentésűek, az X jel által képviselt aminosav adott esetben a G jel által képviselt csoportot hord, amikor X a^-diaminobutirilcsoportot jelent — a lineáris oldalláncot a polipeptid gyűrűhöz kötő peptidkötés szelektív hidrolízisével. Ezt a hidrolízist enzimatikus úton végezzük alkalmas hőmérsékleten, pH-nál és időtartammal. Ennek a szelektív hidrolízisnek a végrehajtására különféle proteolitikus enzimek képeseik, nevezetesen azok az exocelluláris proteázok, amelyeket különféle Bacillus subtilis törzsek termelnek, mint a szubtilizin, a nagarsz, a pronáz, a kolisztináz és az alkaláz, vagy a B. subtilis GLAXO 417, B. subtilis ATCC 9524 vagy Bacillus THE 4 által termelt proteázok. A felhasznált enzimtől függően előnyösen 20 és 70 C° között és 5 és 9 közötti pH-ra pufferolt közegben dolgozhatunk. A IV általános képletű vegyületek — ebben a képletben G, K, X és Y—Z a fenti jelentésűek — III általános képletű polimixinekből állíthatók elő a peptidkémiában az aminfunkciók megvédésére használatos módszerek segítségével. Különösen előnyös egy Py—CH2 —O— CO—O—T V általános képletű vegyes karbonátot reagáltatni — ebben a képletben Py a fenti jelentésű, és T adott esetben szubsztituált fenilcsoportot, például p-nitrofenil- vagy 2,4,5-tri-klórfeinilcsoportot, vagy egy heterociklikus csoportot, például 8-kmolil- vagy 2,5-dioxo-l-pirrolidinilcsoportot jelent —. A reakciót előnyösen dimetilformamidban hajtjuk végre 15 és 60 C° között. Az V általános képletű vegyes karbonátok Cl—CO—O—T VI 5 általános képletű klórformiátokból --- ebben a képletben T a fenti jelentésű — állíthatók elő egy Py—CH2 —OH VII 10 képletű alkohollal — ebben a képletben Py a fenti jelentésű —. Ezt a reakciót előnyösen piridinben hajtjük végre 0 C°-on vagy piridin és metilénklorid elegyében 0 és 20 C° között. 15 Azok a IV általános képletű peptidek, V általános képletű vegyes karbonátok, illetve VII általános képletű alkoholok, amelyek képletében Py N-oxido-piridilcsoportot képvisel, a megfelelő nem oxidált termékből állíthatók elő alkalmas 20 peroxidálószerrel, például p-nitroperbenzoésavval. Rendszerint iners szerves oldószerben dolgozunk, ez lehet egy alkohol, mint a metanol, egy klórozott oldószer, mint a kloroform, vagy egy észter, mint az etilacetát; a reakcióhőmér-25 séklet 0—25 C°. Az I általános képletű termékek adott esetben megtisztíthatók fizikai módszerekkel, mint az átkristályosítás, kromatografálás vagy ellen-30 áramú megosztás, vagy kémiailag, például alkalmas savakkal savaddíciós sókká való átalakítás, ezek átkristályosítása és lúgos közegben való elbontása útján. Ezekben a műveletékben a só anionjának természete közömbös. 35 A következő példákban ismertetjük a találmány szerinti eljárás végrehajtását korlátozás szándéka nélkül. 40 1. példa 109,1 g 3-hidroximetil-piridinnek 500 ml piridinnel készült 0 C°-ra hűtött oldatához kis részletekben 75 perc alatt hozzáadunk 201,54 g p-45 -nitrofenilklórformiátot. A reakciókeveréket 1 óra hosszat 0 C°-on keverjük, majd 20 C°-ra hagyjuk melegedni, és a keverést ezen a hőmérsékleten 16 óra hosszat folytatjuk. Ezután hozzáadunk 1,6 liter metilénkloridot, és 3 ízben 50 500 ml vízzel, majd 500 ml telített nátriumklorid oldattal mossuk. A szerves oldatot nátriumszulfáton megszárítjuk, és 20 torr nyomáson 50 C°-on bepároljuk. Az így kapott olajat 1,6 liter etanolban oldjuk, és az oldatot 0 C°-on 16 óra 55 hosszat állni hagyjuk. Az eközben kivált csapadékot szűrőre visszük, 100 ml etanollal mossuk, és 0,3 torr nyomáson bepároljuk. Így 128 g vegyes (3-piridil-metil)-(p-nitrofenil)-karbonátot kapunk 93 C° olvadásponttal. Rf = 0,73 (kova-60 savgélen, 2:8 térfogatarányú metanol-l,2-diklóretánban). Összetétel: számított: 65 talált: C 56,94%, H 3,67%, N 10,21% C 57,58%, H 3,86%, N 9,89% 2
