161900. lajstromszámú szabadalom • Eljárás anti-alfa1-fetoglobulin tartalmú, elsődleges rákos májdaganat diagnosztizálására alkalmas szer előállítására
5 161900 6 lén-zsírsavészter, polioxietilénszonbitán-zsírsavészter, polioxietilén-alkolholéter, polioxietilénalkil-ariléter, polioxietilén-riainusolajszármazék stb., továbbá lecitin, szaponin, taurokolinsav stb. E felületaktív szerek közül a nem ionos polioxietilénszorbitán-zsírsavészterek (Tweenek) különösen alkalmasak. A színezék a diagnózis megkönnyítésére használjuk. A színezék lehet például Evarns-lkék, toluidJnkék, briliantzöld, patentfcék, tripánikék vagy amidíeikete 10B Ponceau 3R. E színezékek közül patentkék és triipánkék különösen előnyösek. Tartósítószerként különféle fenolok, például brezol, klórtiimol, timol, paraoxiibenzoésavészter stb., szerves higanyvegyületek, például fenilmerkuriacetát, feniknerkuriborát stb., klóributanol és más alkoholok, nátriumazid és hasonlók használhatók. A következőkben ismertetjük a találmány gyakorlati, végrehajtását. Pufferoldatot készítünk előre meghatározott pH-wal és ionkoncentrációval a diagnosztizáló szer stabilizálására. Ez a pufferoldat előnyösen egy trisz4iidroklorid-nátriumklorid vagy glicin-nátriumklorid puffer, jóllehet oitrát, foszfát, borát és barbiturát pufferek is felhasználhatók. A használt pufferoldat gyengén savas vagy gyengén lúgos lehet 6,5 és 8,5 közötti pH értékkel. Az optimális pH 7,2—8,2. Ezt a pufferoldatot 50—,56 °C-on tartjuk, és feloldjuk benne a tartó anyagot. Célszerű a tartó anyagot 1—15 s/tf% végső koncentrációnak .megfelelő mennyiségben hozzáadni. A fent leírt módon előállított antiszéruimot feloldjuk a fentivel azonos pufferben 1—.10 s/tf %-^nak megfelelő mennyiségben, és a kapott oldatot a tartót tartalmazó pufferoldattal keverjük, mijd hozzáadjuk a felületaktív szert és a színezéket 0,01-HO,20 s/tf%, illetve 0,001—0,005 s/tfP/o koncentrációnak megfelelő mennyiségben. Ha a felületaktív szer taurokolinsav, annak végső koncentrációja 0,2—n0,5 s/tf%. Az így előállított készítményhez tartósítószert adunk 0,1 s/tr%-nak megfelelő mennyiségben. Alapos keverés után a készítmény alikvo't részét alkalmas edénybe öntjük, és abban megdermedni hagyjuk. Ezután elkészítjük az immunodiffúziós lemezt, lyukakat fúrva a megdermedt készítményben, amelyekből a vizsgált szérum diffundálhat. Az edénynek, amelybe az elkészült diagnosztizáló szert töltjük és tartjuk, átlátszónak és a nedvesség elpárolgásának megakadályozására hermetikusan lezárhatónak kell lennie. Azonkívül az edény könnyen kezelhető legyen. Ezeknek a követelményeknek színtelen átlátszó műanyagedény felel meg, amelyben a diagnosztizáló szer 2 mm rétegvastagságú; az előzetes műveletek végrehajtása után a diagnózis és a kvantitatív értékelés rendkívül könnyen, gyorsan és pontosan végrehajtható. Amikor a vizsgált egyén szérummmintájét diffundálni hagyjuk az említett immunodiffúziós lemezen precipitin gyűrű képződik, ha a szérumban antigén fehérjék vannak. Ily módon ezzel a próbával felismerhető a primer hepatoma. Az így képződött precipitin gyűrű területe arányos az antigén fehérjék mennyiségével, úgyhogy az antigén kvantitative meghatározható a gyűrű átmérőjének egyszerű 5 megmérésével. Primer hepatoma könnyen felismerhető három készítmény, az egyszeres, tízszeres és százszoros szérumok használatával. Minthogy a fent leírt módon kapott diagnosz-10 tizáió szer lehetővé teszi az antigén mennyiségi meghatározását, különösen előnyös, mert könytnyen megállapítható a prknier hepatoma kifejlődése vagy állapota. A következőkben leírjuk a találmánynak azt 15 a kiviteli alakját, amikor az anti-ai-fetoglofoulint, azaz az antitestet adszonbeáltatjuk egy hordozón, majd azt diszpergáljuk egy diszpergáló közegben. Ilyen diagnosztizáló szer előállítására anti-ai-20 -íetoglobulint adszorlbeáltatunk egy hordozón, majd azt diszpergáljuk egy diszpergáló közegben. Az e célra használt hordozó közönséges adszorber vagy ioncserélő gyanta lehet, például alumíniumszilikát, mint például kaolin, bento-25 nit, agyag, kovaföld stb., magnézwmalumíniumszilikát, sziliciumdioxid, akrilgyonta, polisztirol látex, poMviniitoluol látex, ioncserélő gyanták, például /CTberlite IRA411, IRA93, IR45, IR4B, IRA88 " HO50 (Rohm and Haas Company) és 30 Dov= 'ow Chemical Co.). Minthogy a hordoz-., - -. , .isolja a diagnosztizáló szer adszorpcic' 5L .jatjJitását, előnyösen gömb alakban és egj - . c'es szemcsenagyságban használjuk. A szemcsék átmérője előnyösen 0,5—3 mikron. 35 A?, a^'la-<\H"s:oglofbtulinnak ezen a hordozón ,w '' ad'?'' 'l»-»páltatásáina a hordozót alkalmas v; Zerc'-ritjum diszpergáljuk, majd a diszperzióbe? hoz7.áad;\ik az antiszéruimot, és alaposan 40 összerázzuk. A találmány céljára többféle pufferoldat alkalmas. Például trisz-Jiidroklorid-nátriuimklorid puffer, valamint citrát, foszfát és borát puff erek előnyösen használhatók. A hordozóból célszerű 45 0,2—5 s/tfi% végső koncentrációnak megfelelő mennyiséget alkalmazni. Az antiszérum mennyisége az lanti-ai-fetoglobulin koncentrációjától függ. Általában az antiszérumot előzőleg feloldjuk a fent említett puffenban 1—10 tf/tf% végső ső koncentrációnak megfelelő mennyiségben, tisztított antitest esetében 0,1—1 tf/tf% mennyiségben, majd az oldatot hozzáadjuk a hordozót tartalmazó puff érhez és alaposan összerázzuk. Ily módon az antiszérumban levő anti-ai-feto-55 globulin a hordozón adszorbeálódva anti-ai-fetogloíbulin-hordozó kombinációt szolgáltat. Ezt az anti^ai-fetoglobulin-hordozó kombinációt elválasztjuk, például oentrifugálással, majd 60 például ugyanazzal a pufferoldattal való mosás után diszpergáljuk a diszpergáló közegben. A diszpergáló közeg célszerűen a fent említett pufferoldatok egyike. Olyan diszpergáló közeget használunk, amelyben az anti-ainfetoglotbulin-65 hordozó kombináció egyenletesen diszpergálódik. 3
