161849. lajstromszámú szabadalom • Eljárás A16886 antibiotikumok előállítására

161849 25 26 16. példa: Másik spórázotrt; Streptamyices elavuligerus NRRL 3585 tenyészetet állítunk elő, az organizmust ferde agar csövön növesztve. A cső össze- 5 térele a következő: Dextrin kazeinhidrolizátum („N-Z-amine-type A", Sheffield Chemical Company) éleszt őextraktum marhahúsextraktum kalciumklorid heptahidrát Meer agar ionmentesített víz 10,00 g 2,00 g 1,00 g 1,00 g 0,01 g 20,00 g 1 liter A táptalaj pH-ját nátriumhidroxiddal 7,0 értékre állítjuk be. Az . agiarosöivet iStreptomyces clawuligerus NRRL 3585 spórákkal oltjuk be, és 7—10 napig 30 °C-on inkubáljuk. Az agarcsőhöz 2,0 ml marhahússzérumot adunk, és a spórákat kaparással eltávolítjuk a cső felületéről. Ezután a keletkezett szérumos spóraszuszpenzióból 0,1 ml-t steril liofilizáló csőbe mérünk és gömbalakúvá liofilizáljuk. Az így keletkezett golyókat használjuk a következő összetételű vegetatív táptalaj inokulálására: Glicerin 10,00 g szahiaróz 20,00 g Nutrisoy por 15,00 g Amber BYF 300 5,00 g tripton 5,00 g káliumbifoszfát 0,20 g csapvíz 1 liter A táptalaj pH-ja 6,2, melyet nátriumhidroxiddal pH 6,5-re állítunk be. 17. példa: Az A16886 Antibiotikum irányított termelése 40 literes rozsdamentes acél fermentorba 24 liter, következő összetételű táptalajt adagolunk: Antifoam A (új, a Dow Corning Company által forgalomba hozott habzásgátló szer) 5,00 g Keményítő 1125,00 g Nadrisol 125,00 g szójaliszt 500,00 g glicerin 187,50 g N—Z amine A 125,00 g vas-II-szulfát heptahidrát 2,50 g hideg csapvízzel 24 literre töltve. 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 A kezdeti pH 5,9, melyet körülbelül 20 ml 5 N nátriumhidroxiddal 6,5-re állítunk. A táp- fi5 talajt 30 percig 120 °C-on és 15—18 psig-nél sterilezzük, majd lehűtjük, és a 16. példában előállított 5% vegetatív inokulummál oltjuk be. A fermentációt 30 °C-on végezzük 66 órán át, steril levegővel 0,35 tf./tf./perc értékkel levegőztetve, és mechanikus keverővel 420 fordulat/perc fordulatszámmal keverve. A végső pH-érték 6,3. Az A16886 antibiotikumot a 18. példában leírt eljárással tárjuk fel a fermentléből. 18. példa: A nyers A16886 antibiotikum izolálása monoammóniumsóként A 17. példa szerint előállított fermentlé kb. 75 literét Hyflo-Super-Cel-en (diatomaföld, gyártja Johns-Manville Products) szűrjük, 100 ml-re 5 g segédanyagot számítva. A szürletet egy 9,5x130 cm-es oszlopon engedjük át, amely 8 liter szénnel (Pittsburgh 12x40) van töltve. Az átfolyás sebessége 60 ml/perc. Az oszlopot 10 liter ionmentesített vízzel mossuk (pH 5,2), és a szénen megkötött aktivitást úgy távolítjuk el, hogy az oszlopon 50%-os vizes acetont engedünk át. Az aktív frakciókat egyesítjük, vákuumban bepárolva az acetont eltávolítjuk és egy 9,5 cm x 140 emnes, Dowex 1—XI (erős bázikus anion-cserélőgyanta, gyártja The Dow Chemical Co.) gyantával töltött, formiátciklusú oszlopra visszük fel. Az oszlopot 10 liter ionmentesített vízzel mossuk, és az aktivitást 0,1 M ammóniumformiát-oldattal távolítjuk el. Az aktív frakciókat egyesítjük és egy 9,5 cmxlOO cm-es, szénnel (Pittsburgh 12x40) töltött oszlopon engedjük át, 60 ml/perc sebességgel. Az oszlopot vízzel mossuk; majd az aktivitást aceton-víz (1:4) eleggyel 60 ml/perc sebességgel mossuk, 15 kétliteres frakciót nyerve, majd aceton-víz (1:1) eleggyel mosva, 18 egyliteres frakciót állítva elő. Az aktív frakciókat egyesítjük, vákuumban bepároljuk, így az acetont eltávolítjuk, majd a maradékot liofilizáljuk. 40 g, fentiekben leírtak szerint előállított egyesített liofilizált készítményt 4 liter metanollal extrahálunk, 16 órán át mágneses módszerrel keverve. A metanolban oldhatatlan részeket leszűrjük, a metanolban oldható részeket pedig 5 térfogat acetonnal kicsapjuk. A csapadékot leszűrjük és szárítjuk. A termelés 20,6 g. Ezt a készítményt minimális mennyiségű vízben oldjuk és 5,8 cmxl20 cm-es, dextránnal töltött (Sephadex G—2,5) oszlopon engedjük át 1 ml/perc sebességgel. Az aiktivitást ionmentesített vízzel eluáljuk, az aktív frakciókat egyesítjük és- liofilizáljuk. 10 g, fentiekben előállított anyagot 256 ml acetonitril-víz (55:45) elegyben oldunk, és 5,5 cmx85 cm-es, acetonitril-víz (7:3) eleggyel készített szilikagéllel töltött oszlopra visszük fel. A felvitelt 3 ml perc sebességgel végezzük. A 13