161697. lajstromszámú szabadalom • Eljárás (-) ciszepoxipropilfoszfonsav előállítására

3 161697 4 ces-törzseket tenyésztünk, amelyeket ugyancsak talajból izoláltunk és a Merck & Co., Inc. tenyészetgyűjteményében MA—2867, MA—2916, MA—2917, MA—3270, MA—3272 és MA—3267 jelöléssel azonosítottunk. Ezeket a tenyészeteket a Streptomyces viridochromogenes species tagjaiként osztályoztuk. Az MA—2903, MA—2867, MA—2916, MA—2917 és MA—3270 jelű tenyészeteket az US Department of Agriculture Northern Utilization Research & Development Division törzsgyűjteményében helyeztük el állandó megőrzésre a következő jelölések alatt: NRRL— 3413, NRRL—3414, NRRL—3415, NRRL—3416, illetve NRRL—3427. Az MA—3269 jelű tenyészetet a Streptomyces wedmorensis speciessel azonosítottuk és az NRRL—3426 számmal láttuk el. A fenti mikroorganizmus-féleségeken kívül megvizsgáltuk más mikroorganizmusok — többek között Streptomyces-törzsek — alkalmazásának lehetőségét, amelyeket vagy a természetből izoláltunk, vagy ezen organizmusok mutációjával állítottunk elő. Ezeket a mutánsokat természetes szelekcióval kaptuk, vagy mutagen ágensek, például X-besugárzás, UV-besugárzás, nitrogénmustárok stb. segítségével állítottuk elő. Mivel lényeges nehézségekkel jár a tiszta (-)cisz-l,2-epoxipropilfoszfonsav elválasztása a fermentleben jelenlevő nagy mennyiségű szenynyezéstől, igen fontos, hogy módot találjunk a fermentleben jelenlevő össz-szárazanyaghoz viszonyított antibiotikum-koncentráció növelésére. A találmány alkalmazása során kimutattuk, hogy egy vagy több bizonyos típusú karbonsav vagy sója hozzáadása a (-) cisz-l,2-epoxipropilfoszfonsav termelésére képes mikroorganizmust tartalmazó fermentléhez fokozza az antibiotikumtermelést. Pontosabban: szerves savak, például glutaminsav, fumársav, borostyánkősav, alfa-ketoglutársav, almasav, oxálecetsav, akonitsav és izocitromsav hozzáadása fermentációs táptalajokhoz az antibiotikum-termelés lényeges növekedését eredményezi. Bizonyos mérvű stimuláló hatás figyelhető meg más karbonsavak, például ecetsav és piroszőlősav alkalmazása esetén is. Az ecetsav és a piroszőlősav esetében viszont kifejezettebb hatást érünk el, ha a savakat valamelyik másik sav, például a glutaminsav jelenlétében alkalmazzuk, mintha bármelyik savat egyedül használjuk. Az antibiotikum-termelés fokozásához szükséges karbonsavmennyiség a konkrét sav és az alkalmazott táptalaj függvényében változik. Az egy adott táptalaj-összetétel mellett alkalmazott sav tényleges koncentrációja az alkalmazott konkrét mikroorganizmus és a fermentációs körülmények függvényében változik. Fokozott antibiotikum-termelést figyeltünk meg olyan táptalajokban, amelyek körülbelül 0,6 — körülbelül 30,0 millimól/1 karbonsavat tartalmaznak, Jó antibiotikum-termelés elérésére azonban célszerűbb kb. 3,0 — kb. 12 millimólA karbonsav alkalmazása. A találmány oltalmi körébe tartozó valamennyi sav fokozza az antibiotikum-termelést, de nem stimulálja, illetve nem gátolja a mikroorganizmus növekedését. A találmány oltalmi körébe tartozó karbonsavak bármely fermentációs közegben alkalmazha-5 tók, amely valamely (-) cisz-l,2-epoxipropilfoszfonsav termelésére képes mikroorganizmust tartalmaz. A termelés fokozására alkalmazott karbonsavat előnyösen vízoldható szervetlen só, például nátrium-, kálium- vagy kalciumsó formájában adagoljuk, bár a szabad sav is alkalmazható. A karbonsav adagolható valamely természetes alakban előforduló karbonsavsó vagy komplex alakjában, amely jelen lehet például az lt,

alkalmazandó konkrét savban vagy savakban gazdag mikrobiális tápanyagokban. A szokásos tápanyagok a következőket foglalják magukban: asszimilálható szénforrás, asszimilálható nitrogénforrás, szervetlen sók, és szükég esetén növe-2Q kedési faktorok. A termelés stimulálására alkalmazható egyetlen sav, de a konkrét sav használható egy vagy több más stimuláló sav jelenlétében, amelyek tápanyagként, vagy további adalékként lehetnek jelen a fermentleben. Ha az an-25 tibiotikum termelésének fokozására több, mint egy — a találmány oltalmi körébe tartozó — savat alkalmazunk, nagyobb stimuláló hatást érünk el az antibiotikum-termelés tekintetében, mint ha csak egyetlen savat alkalmazunk. Ha pl. körül-30 belül 6,0 millimól/1 koncentrációban nátriumglutamátot és nátriumfumarátot adunk a táptalajhoz, az antibiotikum mennyiségét a fermentlében 23,8 ^g/ml-nek találjuk, szemben a nátriumglutamátra meghatározott 16,2 /"g/ml és a nát-35 riumfumarátra meghatározott 18,6 ,«g/ml értékkel ez utóbbi savak egyedül való alkalmazása esetén. Vizsgáltuk a karbonsavak más, a (-) cisz-1,2-epoxipropilfoszfonsav termelését stimuláló vegyületek, például kobalt- és foszforvegyületek 40 jelenlétében való alkalmazását is. Bár a találmány szerinti új antibiotikum felületi és süllyesztett tenyészetben egyaránt előállítható, újabban előnyben részesítjük a fermentáció süllyesztett fázisban való végrehajtását. A 45 kis volumenű fermentációkat előnyösen úgy hajtjuk végre, hogy megfelelő mennyiségű táptalajt mérünk be lombikokba, a lombikokat és ezek tartalmát 120 °C-ra való melegítéssel sterilezzük, a lombikokat beoltjuk valamely (-) cisz-50 -1,2-epoxipropilfoszfonsav-termelő mikroorganizmus, például valamely Streptomyces-törzs spóráival vagy vegetatív sejttenyészetével, lazán bedugjuk a lombikok nyakát vattával, és 3—5 napon át állandó hőmérsékletű helyiségben kö-55 rülbelül 28 °C-on rázógépen folytatjuk le a fermentációt. Nagyobb volumenű termelés esetén célszerű a fermentáció megfelelő, keverővel és a fermentlé levegőztetésére szolgáló berendezésekkel ellátott tankokban való levezetésre. E módszer alkalmazása esetén a táptalajt a tankban állítjuk össze és 120 °C-on való tartással sterilizáljuk. Lehűtés után a sterilizált táptalajt a mikroorganizmus vegetatív sejttenyészetét szolgál-65 tató megfelelő forrással oltjuk be és 2—4 napon