161670. lajstromszámú szabadalom • Eljárás markolidantibiotikum előállítására streptomycestörzs segítségével

161670 A leírás szerint előállított JA 6599 törzs morfológiai és fiziológiai tulajdonságai alapján (melyeket Tresner és Backus osztályozása 1956, értelmében állapítottak meg) a terjedelmes Streptomyces Hygröscopicus (Jensen 1931) Waksman et Henrici 1948 fajhoz sorolható. A JA 6599 törzs morfológiai és fiziológiai tulajdonságait az 1. táblázatban foglaltuk össze. A JA 6599 törzs tenyészoldata igen jó hatást mutat a gram-pozitív baktériumokkal szemben, gyenge hatású a mikobaktériumokkal szemben, és közepestől jóig terjedő aktivitást mutat élesztőgombák és gombákkal, valamint Mycoplasma gallisepticummal szemben is. Az antibakteriális hatású makrolid antibiotikum mellett izolálni lehetett egy gombakárosító antibiotikumot is, mely nem tartozik a polién antibiotikumok közé. Ez az antibiotikum a tenyészoldatból kiválik, és butanolos extrakcióval elkülöníthető. , Az extrakt hatóanyaga — aktivitási teszt és papír kromatográfiai vizsgálatok alapján — a ciklohexímid-csoportbeli antibiotikumhoz tartozik. A JA 6599 törzs tenyésztése aerob körülmények között történik. A talajból szárított spóraanyagból kiindulva megfelelő agartáp tála jókat és ezt követően erre alkalmas folyékony tápanyagokat oltunk be. Ezek a táptalajok szénforrásként pl. keményítőt, szacharózt, glükózt és nitrogénforrásként pl. szójabablisztet, élesztőt vagy kukoricalekvárt tartalmaznak. Az antibiotikum-képződés maximumát általában a harmadik-ötödik napon éri el, ha a hőmérséklet 28—32 °C, előnyösen 30 °C. Tenyészoldatból a makrolid antibiotikumot vízben oldhatatlan oldószerrel, mint halogén-szénhidrogénekkel, ketonokkal, észterekkel, előnyösen butilacetáttal extraháljuk ki. Az extraktumból a bázikus antibiotikumot mint sót reextrakcióval, vizes, savas oldattal mint pufferoldattal vagy hígított savval vizes fázisba visszük át. A vizes extraktum betöményített oldatából a hatóanyagot alkalikus tartományban kicsapjuk, mlyet halogén-szénhidrogénekkel vagy észterekkel, előnyösen kloroformmal extrahálunk. A betöményített kloroformos extraktumból az A 6599 antibiotikum petroléter hozzáadására kicsapódik. Azt találtuk, hogy a nagy tisztaságú A 6599 makrolid antibiotikum tiszta bázis formájában állítható elő, ha a nyers bázis acetonos oldatát, adott esetben aktív szenes derítés után — melynél az A 6599 antibiotikum nem adszorbeálódik — alumíniumoxiddal töltött kromatográfoszlopon engedjük át. Az oldat színes szennyeződései az oszlopon visszamaradnak. Az aktív frakciót aceton helyett kloroformban feloldjuk, majd a színtelen antibiotikumot petroléterrel kicsapjuk. Az A 6599 makrolid antibiotikumok előállítására szolgáló találmány szerinti eljárás abból áll, hogy az antibiotikumot a tenyészet oxálsav hozzáadásával tisztára szűrt oldatából pH 8-on butilacetáttal extraháljuk, majd ebből az extraktból 0,01 n kénsavval visszaoldjuk. A vizes-savas oldatot ezután semlegesítjük, majd betöményítjük és az A 6599 antibiotikumot pH 8-on kloroformmal extraháljuk. A koncentrált kloroformos oldatot petroléterbe csepegtetjük, így az A 6599 5 makrolid antibiotikum-bázis kicsapódik. A nyers bázist acetonos oldatból Brockmann-féle alumíniumoxiddal töltött kromatográfoszlopon tisztítjuk. A biológiailag aktív acetoneluátumot bepároljuk, kloroformban feloldjuk, majd a 10 makrolid antibiotikumot petroléterrel kicsapjuk. Az eljárás másik kiviteli módja szerint a nyers bázist — ezen kívül még — hidrogén formájú kationcserélő gyantán végzett abszorpcióval is tisztíthatjuk, előnyösen Wofatit CP gyantán. 15 ioncserélő gyantáról az A 6599 antibiotikumot savas vagy bázikus pufferoldattal, előnyösen ammónia-ammóniumklorid-pufferrel (pH = 9,5) vagy citrát-pufferrel (pH = 4,9) eluáljuk, majd ezt követően a bázist kloroformmal extraháljuk 20 (pH = 8) és az A 6599 makrolid antibiotikumot petroléterrel kicsapjuk. Ez az eljárás természetesen az antibiotikum tehyészoldat szűrletéből való elkülönítésére is alkalmas. Az antibiotikum, melyet a törzs szerint A 25* 6599-cel jelölünk, kicsapással fehér, amorf anyagot, átkristályosítva fehér tűkristályokat képez. Az A 6599 antibiotikum olvadáspontja 129—134 °C, fajlagos forgatóképessége [a]j=, = —66,0° + 0,2° (c = 2, metanolban), UV-maximuma 232 és 3fc 278 m,«-tól 28)2 m^-ig, molekulasúlya 805. Az antibiotikum klórozott szénhidrogénekben, észterekben, éterben, ketonokban, metanolban, benzolban jól oldódik, vízben és petroléter ben roszszul oldódik. Mint bázis, savakkal sókat képez. 35 Az A 6599 antibiotikum tartarát sóját pl. az antibiotikum-bázis és borkősav ekvimoláris mennyiségével képzett só vizes oldatának fagyasztásos szárításával, vagy a bázis és borkősav ekvimoláris mennyiségével képzett só aceto-40 nos oldatából éterrel kicsapva kapjuk meg. A 135—136 °C olvadáspontú színtelen só jól oldódik vízben, alkoholban és acetonban, rosszul oldódik éterben és petroléterben. Pikrinsavval az A 6599 antibiotikum 129—131 45 °C olvadáspontú, nehezen oldható pikrátját kapjuk. Az acetilszármazék olvadáspontja 120—127 °C, tioszemikarbazon olvadáspontja 138—140 °C és a 2,4-dinitrofenilhidrazon olvadáspontja 126— 130 °C. 50 Az A 6599 antibiotikum kémiai-fizikai

tulajdonságai szerint a leukomicin-(kitasamicin)-hez hasonlítható, bár kromatográfiai tulajdonságaiban eltérés mutatkozik. Az A 6599 antibiotikum és a kitasamicin leszálló papírkromatográfiai módszerrel vizsgálva, butilacetáttal telített foszfátpuffer (pH = 8) mint futtatószer alkalmazásával 5—8 komponensre választható szét. Ezen túlmenően megállapítható az egyes komponeng. sek minőségi azonossága, bár mennyiségileg különböznek egymástól. Az „ékcsík'-technika szerint, vékonyréteg-kromatográfiai elválasztással szil'ikagél lemezen, benzol : etilacetát : metanol = = 7:3:1 arányú futtatókeverékkel, háromszori 65 elválasztással és ezt követő 10fl

/o-os kénsavban