161577. lajstromszámú szabadalom • Eljárás amiláz-inhibitor előállítására

MAGYAR NÉPKÖZTÁRSASÁG ORSZÁGOS TALÁLMÁNYI HIVATAL SZABADALMI LEÍRÁS Bejelentés napja: 1971.1.29. (BA-2529) Elsőbbsége: Német Szövetségi Köztársaság, 1970.1.29.. 1970. VI. 11., P 20 03 934.3., P 20 28 739.2. Közzététel napja: 1972. V. 28. Megjelent: 1974. V. 20 161577 Nemzstkozi osztályozás C 07 g 7/00, 7/022 A 61 k 19/02 Feltaláló(k) dr. Schmidt Delf vegyész, dr. Puls Walter orvos, Wuppertal-Elberfeld, Német Szövetségi Köztársaság. Tulajdonos: Farbenfabriken, Bayer Aktiengesellschaft, Leverkusen, Német Szövetségi Köztársaság, Eljárás amiláz-inhibitor előállítására 1 Ismeretes, hogy különböző kis molekulasúlyú anyagok, így a szalicilsav és az abiszcizin a-amiláz-inhibitor hatást lejtenek ki |T. Hemberg, J. Larsson: Physiol. Plant. )4± 861 (1961); T. Hemberg: Acta Chein. Scand. 21, 1665 (Í967)| Ismert az is, hogy egyes, nagyobb molekulasúlyú anyagok t bizonyos amilázok aktibitását nem-specifikus módon, fizikai adszorpcióval |T. Chrzaszcz, J. Janicki: Bioch. L. 260, 354 (1933), Bioch. J. 28^ 296 (1934)1 vagy az enzim denaturálásával és kicsapásával gátolják [B.S. Miller, E. Kneen: Arch. Biochem. 15^ 251 (1947), D.H.Struhmeyer,' ;o M.H. Malin: Biochem, Biophys, Acta 184^ 643 (1969)1 Ko-' rabban már észlelték azt is, hogy a búzából desztillált vízzel olyan anyag vonható ki, amely a nyál-amüaz dextranképzó aktivitását csökkenti, azonban a hasnyálmirigy-amiláz aktivi-' tását csak kis mértékben befolyásolja IE. Kneen, R.M. v-Sandstedt: Arch. Bioch. 9^ 235 (1946)1. A fent ismertetett anyagok egyik komol> hátránya, hogy az amilázok aktivitását nem-speeifikusan gátolják, ill. ezek az anyagok a kísérletek szerint csak igen kis mértékű hasnyál* mirigy -amiláz inhibitor hatást fejtenek ki, azaz 90%-os, vagy >. nagyobb enzimgátló hatás csak igen nagy inhibitor: enzim arány esetén érhető el. Ez a tény az 1. ábra görbéiből is leolvasható. Az 1. ábrán a találmányunk szerint előállított amiláz-inhibitor 2,13 amiláz-egység (AE) mennyiségű hasnyálmirigy- amilázzal szemben kifejtett gátló hatását (A. görbe) "> hasonlítjuk össze az Arch. Bioch. 9, 235 (1946) szakcikkben ismertetett inhibitor gátló hatásával (B. görbe). Azt találtuk, hogy a búzából (búzadarából, búzalisztből vagy búzasikérből) vizes elektrolit-oldatokkal, előnyösen híg savakkal vagy víz— 1-3 szénatomos alkohol-elegyekkel cél- JO szerűen savas kémhatású víz-alkohol elegyekkel nagy hozammal vonhatunk ki olyan inhibitort, amely a hasnyálmirigy-amiláz aktivitását nagymértékben gátolja, és nem rendelkezik a korábban említett hátrányos tulajdonságokkal IAZ így előállított hatóanyag már igen kis inhibitor: enzim Jb arány esetén is 90^nál nagyobb mértékben gátolja a hasnyál mirigy-amiláz aktivitást (lásd 1. ábra), és ugyanakkorjelentős iíVdl-aiiula/uilnbiloi halasi lejt ki. Vizsgalataink szerint a fenti inhibitor nem gátolja az egyéb hidrolázok - pl. tripszin, pepszin, kimotripszin és ribonukleázok - aktivitását. A kiindulási anyagok között felsorolt búzasikér a búz* keményítő előállítása során melléktermékként képződő búzalehérie IHagers Handbuch der pharmazeutischen Praxis, h kötet 332. oldal (Verlag Julius -.von Springer, Berlin} 1925);M.J. Blish, M.L. Anson, J.T. Edsall: Advances in Protein Chemistry II. kötet, 337. oldal (Academic Press, New York, 1945)k Az új inhibitor színtelen, vízben, híg savakban, híg Ingókban és vizes alkoholokban jól oldódó anyag. Az inhibitor 0 1 ^-os vize-, oldatának ultraibolya abszorpciós spektrumát a 2. ábrán mutatjuk be. A spektrumban 278 nm-nél jelenik meg abszorpciós maximum. A hatóanyag éterben, aceton ban és vízmentes alkoholokban nem oldódik. Az új inhibitor nem dializáiható. Az új inhibitor 2-5%-os triklórecetsavval kicsapható; a kapott csapadék vízben oldódik, cs az eredeti hatóanyag-aktivitás 60-80%-ának megfelelő aktivitással rendelkezik. A hatóanyagot proteázok (pepszin, tripszin, kimotripszin) lassan inaktiválják. A hatóanyag oldatai savra (pH = 1-2 értékig) viszonylag nem érzékenyek, lúg hatására azonban a hatóanyag jelentős változást szenved. Ha a hatóanyagot 37 C°-on 0,15 mólos nátriumkarbonát-oldattal (pH = 11,4) kezeljük, 80%-os aktivitáscsökkenés lép fel. A hatóanyag semleges vizes oldatai 85 C° hőmérsékletig stabilak, 90 C°-nál magasabb hőmérsékleten azonban a kezelési idő növelésével az amiláz-inhibitor gyors ütemben inaktiválódik (a kísérletet 0,02 m glicerinfoszfát 0.001 m kalciumklorid puffer-elegyben, pH = 6,9 értéken Végeztük). 2 mól/ 1 mennyiségű karbamid hozzáadására az. inhibitor aktivitása nem változik, 8 mól/l mennyiségű karbamid jelenlétében azonban az aktivitás 50-60%-kal csökken. A 161577