161567. lajstromszámú szabadalom • Eljárás enzimek és enzim-inhibitorok dúsítására

3 161567 4 amelyeket az A-tripszingyanták nem, illetve csak igen kevéssé kötnek meg. A N-gyantákat úgy állítjuk elő, hogy a hordozóból és enzimből illetve hordozóból és enzim-inhibitorból állórendszerhez megfelelő időpontban alifás és/vagy aromás poliaminokat adagolunk, amelyekben csak 1 aminocsoport szabad, valamennyi többi aminocsoport acilezéssel szemben védett Ilyen amin például az N,N-dimetiletiléndiamin, agmatin, N-metUrN'-3-aminopropilpiperazin, 4-aminopiridin, 2-aminopiridin, 3-amino-l-ciklohexil-aminopropán stb. A találmány szerinti eljárás kivitelezése során a kapott, a N-gyantán rögzített komplexet a kisérőanyagok és szennyezések eltávolítására alaposan mossuk vízzel és pufferoldatokkal, végűi disszociáltatjuk. Ez az ismert módon végzett 11 517 753 lajstromszámú NSZK Közrebocsájtási irat disszociáció előidézhető pH eltolással, ésjvagy az ionkoncentráció megváltoztatásával és/vagy kompetitív inhibitorokkal való kiszorítással, illetve szubsztrátokkal - például a tripszin esetében triptaminnal vagy n-butilaminnal • való kiszorítással, és/vagy olyan anyagok hozzáadásával, amelyek, mint például a karbamid és a guanidinsók - képesek a molekuláris kölcsönhatások lazítására, illetve oldására, amit esetleg a reakcióban résztvevő fehérjék reverzibilis denaturálódása MfcBfilV^ . -..- ... Azon enzimek közül, amelyek többé-kevésbé szennyezett oldataikból a találmány szerinti eljárás segítségével dúsíthatok, tisztíthatók és izolálhatok, elsősorban a következőket kell megemlítenünk: tripszin, kimotripszin, kallikrein, plazmin, pépszín, renin, ribonukleáz, trombin, amiláz, papain, hialuronidáz, karbopeptidáz A és B, pankreatopeptidáz E, penicillináz és kolinészterázok. A találmány szerinti eljárás alkalmazásával dúsítandó, tisztítandó és izolálandó inhibitorok közül elsősorban a következőkre utalunk: az ismert kallikrein-tripszin-inhibitor (Kunitz-inhibitor, Trasylol ®), a sertés- és borjúhasnyálmirigybó'l származó, kizárólag tripszintgátló tripszin-inhibitor, az ondóholyagból származó tripszin-inhibitor valamint a növényi magvakból és burgonyából származó tripszin-inhibitorok. A találmány szerinti eljárás ezenkívül lehetővé teszi, hogy ismert enzimekhez új inhibitorokat, és fordítva: olyan új enzimeket találjunk, amelyeket meghatározott inhibitorok gátolnak. Az első esetben a megfelelő enzimet rögzítjük kovalens kötéssel a hordozón, és az így kapott adduktot addig kezeljük az ezen enzim potenciális inhibitorait tartalmazó oldatokkal, míg megszűnik az enzim biológiai aktivitása. Az utóbbi esetben analóg módon, de fordítva járunk el. A találmány szerinti eljárás azzal az előnnyel jár, hogy lehetővé teszi olyan polipeptidek, enzimek és enzim-inhibitorok egyszerűen, jó kitermeléssel, magas tisztasági fokkal való dúsítását, tisztítását és izolálását, amelynek szennyezett oldatból való dúsítása eddig nehéz és hosszadalmas volt. J.példa A vízoldhatatlan N-tripszingyanta előállítása (lásd a 2/1 folyamatábrát). 200 mg EMA-31 (etüén-maleinsavanhidrid kopolimer)gyantát (Monsanto) keverés közben hozzáadunk 20 ml 0,1%-os hexametíléndiamin és 75 ml 0,2 mól sópufferoldat (0,1 mól trietanotamin, 0,1 mól NaCl) 04 C-ra lehűtött keverékéhez (pH 7,8). A szuszpenziót hűtés közben rövid ideig homogenizáljuk, keverjük és (a gyanta hozzáadásától számított) 2 perc múlva 1 g tripszin 75 ml-nyi só-pufferes, hűtött (0-4 (?) oldatával elegyítjük. 4 perces keverés után a reakcióetegyhez hozzáadjuk 4 g N,N-dimetüetaéndiamin (1:1 térfogatarányban vízzel hígított és 2 n HCL-el pH 7,8-re beállított) vizes oldatát, a hűtött reakcióelegyet 2 órán át keverjük és végül centrifugáljuk. A felülúszóban még 320 tripszin található, azaz a bevitt tripszin 68%-a megkötődött a vízoldhatatlan gyantán. A vízoldhatatlan N-tripszingyantát kétszeres térfogatú CeUex XF 1 cellulóz-porral (Biorad Laboratories) keverünk, 04 C-ra hűtött oszlopba töltöttük, majd (1 éjjelen át) addig mostuk pH 7,8 só-pufferoldattal (0,1 mól trietanolamin, 0,1 mól NaCL 0,01 mól CaCl,) (pH. 7,8), míg a lefolyóban már nem volt kimutatható tripszin-aktivítás. Hasonló N-tripszingyanta-kitermeléseket kapunk, 6 ha N,N-dimetiletiléndianin helyett az általános részben megnevezett többi amint alkalmazzuk. 2. példa 10 Inhibitorok izolálása az N-tripszingyanta segítségével a) Specifikus, sertés-hasnyálmirigyből előállított tripszin-inhibitor. A sertés-hasnyálmirigyből származó, 3%-os perklórsawal lg való kezeléssel a nagymolekuláju fehérjéktől mentesített kivonat |H. Fritz, G. Hartwich, E. Werte, Z. phyaol. Chem. 348,150, (1966) az inhibitort 0,014 ImU/ig biuret-protein fajlagos aktivitásban tartalmazza /az Imii definíciójával kapcsolatban lásd az idézett irodalmi helyetjl ImU tripszin 20 körülbelül Uig Trypure Novo ®-t gátol/. A (10 g tripszinből előállított) N-tripszingyantát keverés közben, 0-4 C*-ra való hűtés mellett hozzáadtuk az inhibitort tartalmazó semleges oldat 2,14 1-éhez (745000 ImU tripszinre vonatkoztatva). 2,5 órai keverés után (0-4 C) az 25 elegyet centrifugáltuk, a felülúszót eldobtuk. Az oldhatatlan inhibitor-tripszingyanta-komplexet végül 3-szor felszuszpendáltuk 0,2 mól só-pufferoldatban (0,1 mól trietanolamin, 0,1 mól NaCl, 0,01 mól CaQ,) (0-4 C) és centrifugálás után mindig eldobtuk a felülúszót A gyanta-komplexet 30 ezután 0,2 mól Kd-oldatban felkevertük, a szuszpenzió pH-ját 2 n HCl hozzáadásával 2,0-re állítottuk be, majd hűtés közben 1,5 órán át kevertük. Az elegyet ezután centrifugáltuk és a maradékot (enzimgyanta • gyanta-komplex) a leírt módon mégegyszer kezeltük 0,2 mól pH 2,0 K.C1/HC1-35 oldattal. A két egyesített felülúszóban összesen 458600 ImU tripszinnek megfelelő inhibitor- mennyiség, azaz az izolálandó mennyiség 68,5%-a volt jelen. Az inhibitor-preparátum fajlagos aktivitása Q,32 ImU/ng biuret-fehérje, Sephadex G 25 (a Pharmacia cég, Uppsala, Svédország dextrán-gélje) 40 oszlopon való sómentesítés után pedig 2,73 lmUlpg biuretprotein. A mellékelt rajzon a serlés-hasnyálmirigyből származó inhibitor disszociációs viszonyait mutatjuk be N- illetve A-inhibitorgyantával alkotott komplexből kiindulva. Látható, 45 hogy N-gyantából kiindulva a leoldódás kevésbé savas tartományban következik be, mint A-gyantából kiindulva. b A borjú- szervekből származó polivalens kallikreininhibitort (Kunitz-inhibitor, Trasylol®) a sertés- Jiasnyál-" mirigyből származó specifikus tripszin-inhibitorhoz O.a. 2/a. 50 példát) hasonló módon dúsítottuk az N-tripszingyantán. A polivalens inhibitor egy N- ilieve A-tripszingyantával alkotott vízoldhatatlan komplexe disszociációs viszonyait a vizes szuszpenzió különböző pH-értékei mellett ugyancsak a rajzon mutatjuk be. Kiindulási anyagúi technikai kallikrein-inhibitor 56 szolgálta. Ebből az N-tripszingyantán 86%-os kitenneléssel 3,75 ImUVg fehérje specifikus aktivitású tiszta kallikrein-inhibitort kaptunk (a kisérlet részletei a 2/a. példában megadottakkal azonosak), c.) Szójabab-inhibitor. 80 Szójababból kiindulva a tripszirt-kimotripszin- inhibitort (molekulasúly 23000) a 2a. példában leírthoz hasonló módon dúsítottuk. Kiindulási készítményként egy 0,36 ImU/jig fehérje tripszinre vonatkoztatott specifikus aktivitású, technikai inhibitor-preparátum szolgált (szójababból 66 származó inhibitor, pract, a Serva, Heidelberg cég lioftlizátuma). 5 g, teljesen megkötött tripszinből semleges N-tripszingyantán 149400 ImU tripszinre vonatkoztatott aktivitású készítményt állítottunk elő. A N-tripszingyantainhibitor-komplex 0,3 mól KCl-HCl-pufferben való 1 órás 70 keverés után a megkötött mennyiség 90%-a, azaz 135000 ImU a felülúszó oldatban (150 ml) volt található. A szójababból így izolált inhibitor specifikus aktivitása a Sephadex G25 oszlopon (120x3 cm, 0,01 mól pH 8,0 kollidinacetát-puffer) való sómentesítés után 2,0 ImU/jig •76 biuret-fehérje; ez közel hatszoros dúsulásnak felel meg. 2