161542. lajstromszámú szabadalom • Eljárás B-5050 antibiotikum-komplex és a komplex egyes komponenseinek előállítására

9 161542 10 on, célszerűen 23—32 °C-on végezzük a tenyésztést. A B—5050 antibiotikum komponenseit a tenyésztés során képződött fer mentié tartalmazza. Az antibiotikus hatóanyagokat a metabolitok elválasztására általánosan alkalmazott módszerekkel különíthetjük el. Az elkülönítést annak figyelembevételével végezzük, hogy az antibiotikus hatóanyagok gyengén bázikusak és zsírokban oldódnak. Tekintettel arra, hogy a B—:5050 antibiotikum főtömege a tenyészet folyadékfázisában halmozódik fel, az elkülönítés első lépésében a micéliumot szűréssel eltávolítjuk, majd a szűrt fermentlé kémhatását gyengén bázikus értékre állítjuk, és a* hatóanyagokat vízzel nem elegyedő szerves oldószerrel kivonjuk a szűr létből. A fentieknek megfelelően a szűrt fermentlé pH-ját pl. kb. 7—10 értékre állítjuk, majd a folyadékfázist vízzel nem vagy nem teljesen elegyedő oldószerrel, pl. rövid szénláncú zsírsavészterrel (így etilacetáttál vagy n-butilacetáttal), halogénezett alifás szénhidogénnel (így kloroformmal vagy etilénkloriddal), ketonnal (így metiletilketonnal vagy metil-izobutil-ketonnal), aromás szénhidrogénnel (így benzollal vagy toluollal), alkohol'al (így n-butanollal), ül. a felsorolt oldószerek elegyeivel extraháljuk. A micéliumban jelenlevő antibiotikumot a tenyészet szűrése után vízzel elegyedő szerves oldószerrel, pl. acetonnal vagy metanollal vagy híg vizes savoldattal vonjuk ki a micéliumfázisból. A kapott szerves oldatból szűréssel, vákuumbepárlással, és vízzel nem elegyedő szerves oldószeres extrakcióval különíthetjük el a hatóanyagokat. Extrahálószerként a fent felsorolt anyagokat alkalmazhatjuk. A savas vizes oldatot szűrjük, a szűrlet pH-ját semleges vagy gyengén bázikus értékre állítjuk, majd a vizes oldatot vízzel nem elegyedő szerves oldószerrel —f pl. a fent felsorolt oldószerekkel vagy azok elegyeivel — extraháljuk. A tenyészetben levő hatóanyagokat adszorbenseken, pl. aktív szénen, kolloid szilíciumoxidon vagy hasonló anyagokon is megköthetjük. Az adszorbeált hatóanyagokat megfelelő eluálószerékkel, pl. vizes alkoholokkal (így vizes metanollal vagy vizes etanollal), vizes acetonnal vagy az említett vizes oldatok, sav és szerves oldószerek (pl. etilacetát vagy kloroform) elegyével oldhatjuk le. Tekintettel arra, hogy a B—5050 antibiotikum bázikus jellegű, a hatóanyagokat kationcserélő gyantán, pl. Amberlite IRC—50, Amberlite IR— 120 (gyártó: Röhm & Haas Co., USA) vagy Dowex 50 gyantán (gyártó: Dow Chemical Co., USA) is megköthetjük. A kationcserélő gyantákon adszorbeált hatóanyagokat megfelelő eluálószerekkel, pl. híg vizes savoldatokkal, híg vizes bázisoldatokkal vagy vizes-metanolos savoldattal, vizes-metanolos bázisoldattal, vizes-acetonos savoldattal, vizes-acetonos bázisoldattal vagy hasonló anyagokkal oldhatjuk le. Az így kapott szerves kivonatot előnyösen vízzel mossuk, majd vizes savoldathoz adjuk. Vizes savoldatként híg vizes savoldatokat vagy savanyú pufferoldatokat alkalmazhatunk. Az így kapott vizes kivonat pH-ját ezután semleges vagy 5 gyengén bázikus értékre állítjuk, és az elegyet a fent ismertetett módon vízzel nem elegyedő szerves oldószerekkel extraháljuk. Ha a fenti eljárás során viszonylag nagy menynyiségű hatóanyagot tartalmazó szerves oldato-10 kat kapunk, a B—5050 antibiotikumot vákuumbepárlással kristályos formában elkülöníthetjük. Ellenkező esetben a vákuumbepárlás során kapott maradékhoz nem poláros szerves oldószert, pl. petrolétert vagy n-hexánt adunk, és a kivált 15 nyers, por alakú B—5050 antibiotikumot szerves oldószerből, pl. benzolból, dietiléterből, etilacetátból, etilacetát és n-hexán elegyéből, aceton és n-hexán elegyéből, aceton és víz elegyéből vagy etanol és víz elegyéből átkristályosítjuk. 20 A nyers por alakú termék egyes esetekben színes szennyezőanyagokat is tartalmazhat. A szennyezőanyagokat aktív szenes derítéssel távolítjuk el. - Ha a fenti eljárással nem kapunk kristályos 25 B—5050 antibiotikumot, a nyersterméket szilikagélen vagy alumíniumoxidon tovább tisztíthatjuk. Az adszorbensen megkötött hatóanyagot zsírsavészterekkel (pl. metilacetáttal, etilacetáttal vagy n-butilacetáttal), oldószerelegyekkel (pl. 30 benzol-aceton, benzol-etilacetát, benzol-metanol vagy kloroform-metanol eleggyel) vagy hasonló anyagokkal oldhatjuk le. A B—5050 antibiotikum-elegy és az azt felépítő tiszta antibiotikumok bázikus anyagok, és 35 fgy vízben oldódó savakkal, pl. sósavval, kénsavval, borkősavval, nikotinsavval vagy hasonló aíiyagoKKal sókat képeznek. Az alábbiakban a B—5050 antibiotikum-elegy jellemzőit ismertetjük. Megjegyezzük, hogy a 40 vizsgálatot a 7. példában leírt eljárással előállított B—5050 antibiotikum-elegy mintájával végeztük, és várható, hogy az egyéb antibiotikumminták megfelelő adatai kismértékben eltérnek a felsorolt értékektől. 45 1. Olvadáspont: 137—141 °C. 2. Elemzés: Benzolos átkristályosítás után: C = 58,14 ± 0.5% H = 7,88 + 0,3% 50 N =? 1,73 + 0,3% Etilacetátos átkristályosítás után: C = 57,83 + 0,5% H = 8,14 + = 0,3% N = 1,33 ± 0,3% 3. Gőznyomásméréssel meghatározott mole-55 kulasúly: 800 + 90 (etilacetátban) 4. Fajlagos forgatóképesség: [a]2

*

= — 76,4° + 8° (c = l, etanolban) 5. Színreakciók: Dragendorff-reakció: pozitív 60 Eritromicinpróba: pozitív, vörösesbíbor szín jelenik meg, a kloroformos réteg halványkék Karbomicinpróba: negatív 6. Oldhatóság: metanolban, etanolban, acetonban, etilacetátban, metiletilketonban, kloroform-65 ban és vizes savas oldatokban jól oldódik, ben-