161454. lajstromszámú szabadalom • Eljárás cisztintartalmú peptidek előállítására
3 161454 4 A karboxilcsoportokat, ha szükséges, amidálással vagy észterezéssel védhetjük. Észterként pl. a metanol, etanol, benzilalkohoL p-metoxibenzilalkohol, 2,4,5-triklórfenol, N-hidroxiszukcinimid. N-hidroxiftálimid vagy mindenekelőtt a tercier butanol észterei említésre méltóak. A pl. aszerint - vagy triozin- gyökök hidroxil-csoportjait pl. benzilalkoholos vagy előnyösen tercier butanolos éterezéssel védhetjük meg. Az arginin gyökökben a guanidino-csoportokat pl. tozil-csoporttal védhetjük meg. A találmány szerinti eljárással előállított védőcsoportokat tartalmazó diszulfid-peptideket közvetlenül fehasználhatjuk hosszabb aminosavláncu peptidek szintézisére, vagy ha szükséges, a védőcsoportokat az ismert módon hidrolízissel vagy hidrogénezéssel lehasíthatjuk. A kiindulási anyagokként használt ciszteintartalmú peptidek és származékaik ismertek, vagy önmagukban ismert módszerekkel előállíthatók. Származékok alatt az olyan peptidek értendők, melyekben a funkcionális csoportok, pl. az aminocsoportok, karboxilcsoportok, hidroxil-csoportok a fentiekben említett vagy más, a peptidszintézisben ismert védőcsoportokkal vannak ellátva, valamint az olyan vegyületek, melyek az egyik vagy mindkét kötendő cisztein-gyök helyett dezaminocisztein-gyököt tartalmaznak. A találmányt a következő példákban ismertetjük. A hőmérsékleti értékeket Celsius fokokban adjuk meg. A vékonyrétegkromatográfiás eljárások során a következő rendszereket használjuk: 43 A rendszer: tercier-amualkohol-izopropanol-viz (1OQ :40:10) 43 C rendszer: tercier-amflalkoholrizopropanol-viz (51:21:28) 45 rendszer: szekunder-butanol-3%-os vizes ammóniaoldat (70:30) 52 rendszer: n-butanol-jégecet-viz (75:7,5:21) 53 rendszer: n-butanoHiangyasav-viz (60:0,75:39) 70 rendszer: etilacetát-piridin-viz (40:20:40) 101 rendszer: n-butanol-piridin-jégecet-víz (38:24:8:30) 102. E rendszer: etilacetát-metiletilketon-jégecet-viz (50:30:10:10) 121 A rendszer: izopropanol-ammóniaoldat (26%-os)-viz (85:5:10) A következő rövidítéseket használjuk: BOC = tercier butiloxikarbonil; TRI = tritil; DPC = 2-(p-bifenilil>2-propiloxikarbonil; Z = benziloxikarbonil; Me = metil; tBu = terc-butil. Az 1. példa a diszulfid gyűrűt tartalmazó tirokalcitonin védett N-terminális 1-9 szekvenciájának előállítását mutatja be; a 2. és 8. példa az inzulin A lánca 20-21 védett részének a védett 18—21 részével, ill. A B lánc 19-21 védett részével való diszulfid kapcsolását mutatja; a 3., 7. és 9. példákban diszulfidhiddal rendelkező > védett peptid-dimerek előállítását írjuk le; míg a 4—6. példákban Oxitocin, Lys*-vazopresszin és Phe2-Lys*-vazopresszin előállítása szerepel az új eljárás szerint ;. példa BOC-Cys-Ser(tBu)~-Asn~Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys-Val -Leu-Oh 3,73 g (14,78 mmól) jód kevert 500 ml metanolos oldatához szobahőmérsékleten 2,50 g (1,478 mmól) BOCC y s( T RI)- Ser(tBU)- Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBU)-Cys (TRI)-Val-Leu-OH 500 ml metanolos oldatát csepegtetjük 45 perc alatt. A bevitel befejezése után további 1 órán át keverjük, majd az oldatot 0°-on l,0n vizes tioszulfát oldattal elszintelenítjük (26,05 ml In tioszulfáttal). A tiszta oldatot vízsugárszivattyúval létesített vákuumban 30 °-on kb. 100 ml-re bepároljuk. Ezután 1,5 liter vizet adunk hozzá, a "kicsapódott terméket szűrjük és vízzel mossuk. Káliumhidroxid felett szárítva a nyerstermék súlya 2,32 g lesz. Ezt kétszer petroléterrel eldörzsöljük és tisztítás céljából ellenáramú megosztásnak vetjük alá, metanol-puffer-kloroform-E széntetraklorid (10:3:5:4) rendszerben (puffer: 28,6 ml jégecet; 19,25 g ammóniumacetát, vízzel 1 literre töltve). 135 részlet után a főtermék a 39—68. frakcióban található (rmax - 53,K = 0,65). Ezeket a részleteket egyesítjük és nagy vákuumban (40 °-on) szárazra pároljuk, majd az ammónium-10 acetát elszublimáljuk. A keletkezett BOC-Cys-Ser(tBu)-Asn -Leu-Ser(tBu>Thr(tBU)-Cys-Val-Leu-OH (1,49 g, az elméleti 83%-a) vékonyrétegkromatográfiásan (szilikagélen) egységes. Rf45 = 0,42; RfniA = °-7 °; Rf 70 = °< 15 '< Rf 53 = 0,43; Rf43A = 0,22. [a] -2 ~- = -16° (c = 2, kloroformban). A kiindulási anyagként alkalmazott védett nonapeptidet a következőképpen állítjuk elő: 1) H ThrltBul OMe 12,92 g (40 mmól) Z-Thr(tBu)-OMe vegyületet 200 ml 20 jégecetben 3 g Pd-szén (10%) katalizátorral szobahőmérsékleten hidrogénezzük. A hidrogénfelvétel 1 óra múlva befejeződik. Az oldatot megszűrjük a katalizátortól és vízsugárszivattyúval létesített vákuumban 35°-on bepároljuk. 35°-on nagy vákuumban szárítva 7,3 g olaj keletkezik, amely 25 vékonyrétegkromatográfiásan egységes, és közvetlenül tovább használható. 2) DPC~Ser(tBuj-Thr(tBu)-OMe 19,3 g (38,6 mmól) DPC-Ser(tBu)-OH ciklohexil-30 aminsót 500 ml kloroformban felveszünk és 0°-on háromszor 25 ml In citromsawal és ötször 40 ml félig telített konyhasóoldattal kirázzuk. Az oldatot nátriumszulfát felett szárítjuk, majd bepároljuk és a keletkezett habot 250 ml etilacetátban felvesszük. 5,36 ml (38,6 mmól) trietilamint 35 adunk hozzá, az oldatot -10°-ra hűtjük le, és keverés közben 5,13 ml (38,6 mmól) klórhangyasav izobutilésztert adunk hozzá. 10 percig -10°-on keverjük, majd -12°-ra hűtött 7,3 g (38,6 mmól) H-Thr(tBu)-OMe 100 ml etilacetátos oldatát csepegtetjük hozzá úgy, hogy a reakcióhőmérséklet ne 40 emelkedjék -10° fölé. A hozzáadás befejeztével további 1 órán át -10°-on keverjük, majd egy éjszakán át szobahőmérsékleten állni hagyjuk. Az oldafot megszűrjük a kivált trietilamin-hidrokloridtól és 0°-on háromszor 20 ml 1 n citromsawal és ötször telített konyhasóoldattal mossuk, 45 szárítjuk és bepároljuk. A nyerstermék (olaj) súlya 22,07 g. Tisztítás céljából 1 g-ot szilikagél oszlopon (2,5 x 30 cm) kromatografálunk. Petroléter-etilacetát eleggyel 110 ml lefutása után 787 mg tiszta terméket eluálunk. Vékonyrétegkromatográfiával szilikagélen toluol-aceton (7:3) eleggyel az 50 Rf-érték0,51. 3) Z- Val-Leu-OMe 19,9 g (110 mmól) H-Leu) OMe.-HCl-t 12 ml dimetilformamidban oldunk és 0"-on 14,6 ml (105 mmól) trietil-55 amint adunk hozzá. A kivált trietilamin-hidrokloridot leszűrjük, a szürletet 25,1 g (100 mmól) Z-Val-OH 200 m! dimetilformamidos (0°) oldatához adjuk, majd 22,6 g (110 mmól) diciklohexilkarbodiimidet csepegtetünk hozzá szárazon. 0°-on 1 órán át keverjük, majd egy éjszakán át 60 hűtőszekrényben tartjuk, szűrjük és az oldatot nagy vákuumban 40°-on bepároljuk. Az olajos maradékot 30 ml etilacetáttal felvesszük, az oldatot 0°-ra hűtjük és eltávolítjuk a kivált diciklohexilkarbamidot, n-hexánt hozzáadva a szűrletből a termék egy éjszaka alatt kikristályosodik. Op.: 65 102 - lOS^l ^ = -41° (c = 2,88 metanolban). Szilikagélen végzett vékonyrétegkromatográfiával, kloroform-metanol (98 : 2) rendszerben Rf=0,55 és toluol-aceton (7 : 3) rendszerben az Rf=0,60. 70 4) DPC-Ser(tBu)-Thr(tBu)-NH-NH t 4,253 g (7,4 mmól) ÜPC-Ser(tBu)-Ihr(tBUj-üMe 18 ml metanolos oldatát 5,55 ml (kb. 110 mmól hidrazinhídráttal egyesítjük és 10 órán át szobahőmérsékleten és 2 órán át 76 40°-on állni hagyjuk. A reakcióelegyet 450 ml etilacetátban
