161414. lajstromszámú szabadalom • Eljárás racém prosztaglandin-F-analógok előállítására
161414 45 46 epi-PGE2 -vé; NMR-csúcsok 5,8 — 5,6(multiplett), 5,6-5,34,5-3,9 (multiplett) és 0,9 (triplett) ő-nál. 19. példa. Racém 5,6-dehidro-PGE2 (S). 28 mg racém 5,6-dehidro-PGE2 -|S,/3,/?-triklóretil- 5 észter 1,5 ml ecetsav-víz (9 :1 v/v) eleggyel készült oldatához 150 mg cinkport adunk. Ezt a keveréket 2 órán át 25 C°-on nitrogén alatt keverjük. Ezután 4 térfogatrész etilacetátot adunk hozzá. Az etilacetátos fázist 1 n sósavval, majd telített, vizes 10 nátriumklorid-oldattal mossuk, szárítjuk és bepároljuk. A maradékhoz benzolt adunk, majd ezt csökkentett nyomáson elpárologtatjuk. A maradékot 5 g savval mosott szilikagélen (Silicar CC — 4) kromatografáljuk,az eluálást 100 ml 75% etilace- 15 tatot tartalmazó Skellysolve B-vel, majd 100 ml etilacetáttal végezzük és 10 ml-es frakciókat gyűjtünk. A 8.—11. frakciókat egyesítve és bepárolva 21 mg kristályos racém 5,6-dehidro-PGE2 -t kapunk; o. p. 85-90 C°. Etilacetát és Skellysolve B 20 elegyből végzett kétszeri átkristályosítás után az anyag olvadáspontja 89— 91 C°, tömegspektrum csúcsok 332, 314, 296, 261 és 243 értéknél. 20. példa. Racém 5,6-dehidro-15-epi-PGE2 (R). 25 A 19. példa szerinti eljárást követve a racém 5,6-dehidro-15-epi-PGE2 -j3,/3,(5-triklóretilésztert átalakítjuk 5,6-dehidro-15-epi-PGE2 -vé. A 17. és a 19. példa szerinti eljárást követjük és a racém PGE2 , a racém 15-epi-PGE 2 , a racém 30 5,6-dehidro-PGE2 és a racém 5,6-dehidro-15-epi-PGE2 /S,/?,/3-triklóretilészterének /5-izomerjét rendre átalakítjuk racém 8-izo-PGE2 -vé, racém 8-izo-15-epi-PGE2 -vé, racém 5,6-dehidro-8-izo-PGE 2 -vé illetve racém 5,6-dehidro-8-izo-15-epi-PGE2 -vé. 35 Ugyancsak a 17. példa szerinti eljárást követjük és az előbbiekben a 14. példa után meghatározott valamennyi racém PGE2 -típusú vegyület és racém 15-epi-PGE2 -típusú vegyület /3,ß,/?-trikloretileszterét átalakítjuk a megfelelő racém PGE2-típusú 40 savvá és a megfelelő racém 15-epi-PGE2 -típusú savvá, a megfelelő 8-izo-savakat is beleértve. Ugyancsak a 19. példa szerinti eljárást követjük és az előbbiekben a 16. példa után meghatározott valamennyi racém 5,6-dehidro-PGE2 -típusú vegyü- 45 let és 5,6-dehidro-15-epi-PGE2 -típusú vegyület /?,/?,/?-triklóretilészterét átalakítjuk a megfelelő racém 5,6-dehidro-PGE2 -típusú savvá és racém 5,6-dehirdo-15-epi-PGE2 -típusú savvá, a 8-izo-savakat is beleértve. 50 21. példa. Racém PGE2 . A. Enzim készítése. Táptalajt készítünk, amely 2% kukoricalekvárt (cerelóz és glükóz egyenlő részarányú keveréke) 55 tartalmaz csapvízben. Ennek pH-ját sósav hozzáadásával 4,5-re állítjuk be és 1% metiloleátot adunk hozzá. 4 darab 500 ml-es lombikot, melyek a fenti táptalajból 100—100 ml-t tartalmaznak, beoltunk Cladosporium resinae-vel (Cl-ll, ATCC 60 11,274) és rázógépen szobahőmérsékleten (körülbelül 28 C°) 4 napig rázzuk. A tenyészetet ezután 40 ml-es centrifuga-csövekbe helyezzük és klinikai centrifugán körülbelül 2000 ford/perc sebességgel centrifugáljuk. A centrifuga csövekből a folyadékot 65 dekantáljuk és az összegyűjtött sejteket hideg vízzel mossuk. Két centrifugacsőből a mosott sejteket 50 ml jéghideg 0,05 mólos (7,0 pH-jú) foszfát pufferben szuszpendáljuk és elhelyezzük kisméretű jéggel hűtött Waring-keverőben. Üveggyöngyöket adunk hozzá és a szuszpendált sejteket 15 percig keverjük a keverőben. A kapott, zúzott sejteket tartalmazó szuszpenziót klinikai centrifugában szobahőmérsékleten 15 percig kb. 2000 ford/ perc sebességgel centrifugáljuk, majd a szupernatáns folyadékot összegyűjtjük. Ez a szupernatáns folyadék Cladosporium resinae acilázt tartalmaz, és azt közvetlenül felhasználhatjuk PG2-típusú alkilészterek hidrolizálására, vagy előnyösen fagyasztva tárolhatjuk, ameddig az szükséges. B. A racém PGE2 -metilészter észteráz-hidrolízise. A példa A. pontjában leírt módszerrel előállított Cladosporium resinae acilázt tartalmazó szupernatáns folyadékból 10 ml-t és 50 mg racém PGE2 metilésztert szobahőmérsékleten nitrogén alatt rázatunk kb. 19 óra hosszat, majd 70 ml acetont adunk hozzá és az elegyet szűrjük; így szűrletet és oldhatatlan maradékot kapunk. A szűrletet csökkentett nyomáson bepároljuk, és így 40—50 mg kissé sárga olajat kapunk, ami racém PGE2 -t tartalmaz. Ezt az olajat és az oldhatatlan maradékot egyesítjük és 10 g savval mosott szilikagélen (Silicar CC —4, Mallinckrodt) kromatografáljuk. Az eluálást növekvő mennyiségben etilacetátot tartalmazó hexán-izomerekkel (Skellysolve B) végezzük és 50 ml-es frakciókat gyűjtünk az alábbiak szerint: Frakcic ) Oldószer 1. Skellysolve B 2. 40 ml Skellysolve B, 10 ml etilacetát 3. 30 ml Skellysolve B, 20 ml etilacetát 4. 25 ml Skellysolve B, 25 ml etilacetát 5. 20 ml Skellysolve B, 30 ml etilacetát 6. 10 ml Skellysolve B, 40 ml etilacetát 7. 5 ml Skellysolve B, 45 ml etilacetát 8. etilacetát 9. etilacetát 10. etilacetát 11. etilacetát 12. 100 ml etilacetát A 6. —12. frakciókat egyesítve és bepárolva racém PGE2 -t kapunk, lényegében véve a 17. példa szerint kapott anyag tulajdonságaival. A 21. példa szerinti eljárást követjük és az előbbiekben a 14. és 16. példa után meghatározott valamennyi PGE2 -típusú és 5,6-dehidro-PGE 2 -típusú vegyület metilészterét enzimatikusan a megfelelő szabad savvá hidrolizáljuk. Ugyancsak a 21. példa szerinti eljárást követjük és valamennyi PGF2 -típusú, PGA 2 -típusú, PGB 2 típusú vegyület metilészterét, valamint a megfelelő 5,6-dehidro-PG2 -típusú vegyületek metilésztereit enzimatikusan a megfelelő szabad savvá hidrolizáljuk. 22. példa. Racém PGF2« és racém PGFäg. 22 mg racém PGE2 -nek 1,5 ml metanollal készített oldatához cseppenként keverés közben 0 C°-on 23
