161251. lajstromszámú szabadalom • Eljárás sejtmentes penicillinaciláz előállítására
13 161251 14 k) A 2c vagy 2h példa szerint kapott 100 ml oldatot a 7j példa szerint kezeltünk, de dietilaminoetilcellulóz alkalmazása nélkül. 8. példa Az aciláz-aktivitás koncentrálása és tisztítása ultraszűréssel A 2c példa szerint kapott 10 ml oldatot a 7j példában leírt módon ioncserélővel kezelve részben sótalanítottunk és fehérjementesítettünk, de elhagytuk a karboximetilcellulózon való adszorbeáltatásból álló utolsó lépést, majd 40 ml desztillált vízzel hígítottuk, és nyomás alatt átszűrtük az 50 000-nél nagyobb molekulasúlyú molekulákat teljesen visszatartó hártyán (Diaflo hártya, gyártja Amicon Corporation, Cambridge, Mass., Amerikai Egyesült Államok). Az aciláz zömét tartalmazó 2 ml koncén trátumot liofilizáltuk. 9. példa Az aciláz-aktivitás kicsapása ammóníumszulfáttal. a) A 4b példa szerint kapott 1000 ml 358 E/ml aktivitású tisztított acilázoldathoz 570 g ammóniumszulfátot adtunk. A keveréket a só feloldódásáig kevertük. Két óra hosszat 5 C°-on való állás után a képződött csapadékot szűrőn elválasztottuk. 52,5 g nedves terméket kaptunk 5160 E/g aktivitással. b) A 9a példa szerint kapott 47,0 g 5160 E/g aktivitású nedves terméket levegőn 25 C°-on éjjelen át száradni hagytunk. Hozam 19,85 g, aktivitás 7580 E/g. 10. példa Az aciláz-aktivitás tisztítása dialízissel. A 2c példa szerint kapott, 48 E/ml aktivitású acilázoldatból 11 ml-t éjjelen át ionmentesített vízzel szemben dializáltunk. A dializáit oldatot az 5. példában leírt módon liofilizáltuk. Hozam 0,06 g, aktivitás 8000 E/g. 11., példa Az aciláz-aktivitás tisztítása gélszűréssel A 4b példa szerint kapott, 166 E/g aktivitású acilázoldatból 150 g-ot vákuumban bepárolva 9 ml térfogatra koncentráltunk, majd 3 cm átmérőjű és 80 cm magas Sephadex G 75 oszlopon gélszűrésnek vetettünk alá, és ionmentesített vízzel eluáltunk. A kiindulási anyag 15,2%át tartalmazó 80 ml oldatban 21 200 E aktivitást kaptunk 280 m/u, adszorpció alapján mérve. 12. példa E. coli aciláz lekötése polimerekre a) 2,5 ml 4%-os Sepharose 4B agaróz oldatot megszűrtünk, és az elkülönített nedves anyagot 8 percig 11,5.—1 1.0 pH-nál 2 ml 5%-os jéghideg vizfeo brómcianid oldattal kevertük. A gélt szűréssel, elkülönítettük, és a szűrőn jéghideg vízzel és jéghideg 0,1 mólos bórax oldattal alaposan kimostuk. Ezután 4 ml 0,1 mólos bórax oldatban szuszpendáltuk, és 24 óra hoszszat 4 C°-on a 7d példa szerint kapott 0,106 g 159 000 E/g aktivitású E. coli acilázzal kevertük. A keveréket leszűrtük, és az elkülönített anyagot a szűrőn vízzel alaposan kimosva 1,2 g nedves polimert kaptunk 679 E/g fajlagos aktivitással. b) 0,100 g Sephadex G 25-öt 8 percig 11,5— 12 pH értéken 2 ml 5%-os jéghideg vizes brómcianid oldattal kevertünk, és az oldatot megszűrtük. A kapott gélt jéghideg vízzel és 4 ml jéghideg 0,1 mólos bórax oldattal alaposan kimostuk. Hozzáadtunk a 7d példa szerint kapott 0,106 g 159 000 E/g aktivitású E. coli acilázt, és a keveréket 24 óra hosszat 4 C°-on kevertük. Er-után a keveréket beállítottuk 7,5 pH-ra, és szűrtük. A terméket a szűrőn vízzel alaposan kimosva 0,3 g polimert kaptunk 212 E/g fajlagos aktivitással. c) A 12b kísérletet megismételtük 0,1 g Sephadex A 50 dietilaminoetilcellulózzal Sephadex G 25 helyett. A hozam 1,25 g nedves polimer volt 435 E/g fajlagos aktivitással. d) A 12b kísérletet megismételtük Sephadex G 25 helyett 0,1 g cellulózporral (gyártja Macherey, Nagel & Co, MN—300). A hozam 0,35 g polimer volt 261 E/g fajlagos aktivitással. 13. példa 6-Aminopenicillánsav előállítása 35 283 g 42 E/g aktivitású enzimoldathoz hozzáadtuk 20 g benzilpenicillin káliumsójának 317 ml vízzel készült oldatát. A keveréket 37 C°-on inkubáltuk, a pH-értéket 2,5 n nátronlúg időnkénti hozzáadásával 40 7,8-on tartva. Hat óra elmúltával a reakciókeverék 10,7 g (92%) 6-aminopenicillánsavat tartalmazott. Szűrés után az oldat pH értékét 5 n sósav hozzáadásával 3-ra állítottuk be, majd 1/2 térfogat metilizobutilketonnal extrahálva eltá-45 volítottuk a maradék benzilpenicillint és a 6--aminopenicillánsav képződése közben lehasadt fenilecetsav-oldalláncot. Extrahálás után a vizes oldatot elválasztottuk a metilizobutilketontól. A vizes oldat pH értékét 7,5-re állítottuk be,. 50 és térfogatát vákuumban 120 ml-re csökkentettük. A koncentrált oldatot 5 C°-ra hűtöttük, és leszűrtük. A szűrt oldatot 5 n sósavval 4,3 pH-ra megsiavanyítva, kivált a kristályos 6-aminopenicillánsav. A kristályokat szűrőre vittük, ke-55 vés hideg vízzel, majd száraz acetonnal mostuk, és vákuumban megszárítva 8,84 g 6-aminopenicillánsavat kaptunk. A termék tisztasága 95%-os volt, és az összes hozam a benzilpenieillinre számítva 72%. 60 14. példa 6-Aminopenicillánsav előállítása A 2c példa szerint kapott, 33,8 E/g aktivitású 65 enzimoldatból 375 g-hoz hozzáadunk 21 g 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 T
