161218. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 67-694 antibiotikum és gyógyászati célra alkalmas funkciós származékai előállítására

161213 ?1 1. példa Fermentálás rázólombikokban A) Szaporító szakasz 5 100 ml steril táptalajt tartalmazó 300 ml-es Erlenmeyer-lombikba aszeptikus körülmények köaött kb. 0,5 ml Micromonospora rosaria liofilesett kultúrát helyezünk. A táptalaj összetétele: 10 ^ Bacto-húskivonat (Difco) 3 g Bacto-triptóz (Difco) 5 g Bacto-élesztőkivonat (Difco) 5 g glukóz lg 15 burgonyakeményítő 24 g kalciumkarbonát 2 g vízvezetéki víz 1000 ml A lombikok tartalmát 35 °C-on 72 órán keresz- 20 tül rázás közben inkubáljuk. B) Fermentáló szakasz , 25 A szaporító szakaszban kapott oltóanyagból 5-—5 ml-t aszeptikus körülmények között néhány 500 ml-es Erlenmeyer-lombikba viszünk 4t. Ezek mindegyike 100 ml következő összetételű steril táptalajt tartalmaz: 30 Bacto élesztőkivonat (Difco) 5 g kukoricalekvár 1 g keményítő 30 g kalciumkarbonát 1 g 35 vízvezetéki víz 1000 ml A lombikok tartalmát 28 rázás közben inkubáljuk. 5C-on 72—100 órán Az jelső 24 óra után a fermentléből meghatározott időközökben mintát veszünk az antibíotikus aktivitásnak és vele együtt annak az időpontnak a megállapítására, amikor a táptalaj antibiotikus aktivitása a legnagyobb. Amikor ez beállt, a lombikok tartalmát a rákövetkező elkülönítés céljára egyesítjük. A szaporítás és fermentálás ideje alatt a táptalaj pH-értékét a kalciumkarbonát pufferező hatásával a kívánt értéken tartjuk. A fermentálást süllyesztve aerob körülmények között hajtjuk végre. 40 45 50 2. példa Fermentálás tartályban A) Szaporító szakasz 25 ml 1A példa szerint előállított oltóanyagot adunk aszeptikus körülmények között az 1A példában ismertetett összetételű 500 ml táptalajhoz egy 2 literes Erlenmeyer-lombikban. A lombik tartalmát 28 °C-on 72 órán ét rázás közben inkubáljuk. 55 90 <S5 22 B) Fermentáló szakasz A szaporító szakaszban kapott terméket aszeptikus körülmények között egy 14 literes fermentáló edénybe visszük át, amely 9,5 liter IB példában ismertetett táptalajt tartalmaz. 6 ml habzásgátló szert (Dow-Corning B) adunk hozzá, és a keverék pH-értékét n nátriumhidroxid-oldattal vagy n kénsav oldattal 7,0-ra állítjuk be. A keveréket 28 °C-on addig fermentáljuk, amig el nem éri a maximális antibiotikus aktivitást (normális körülmények között 72—100 óra alatt). Az aerob körülményeket percenként kb. 3,5 liter levegő átvezetésével érjük el. 3. példa A 67—694 antibiotikum elkülönítése A 2. példa szerint kapott fermentlé pH-értékét n nátriumhidroxidroldattal 9,5-re állítjuk be, majd 20—20 literes etilacetát adagokkal addig extraháljuk, míg az antibiotikum számottevő részét a léből kivontuk. Ehhez általában 2—5 extrakcióra van szükség. Az egyesített kivonatokat vákuumban 200 ml-re koncentráljuk, a koncentrátumot 200 ml 0,1 n kénsavoldattal újból extraháljuk, a savas kivonat pH-értékét híg nátriumhidroxid-oldattal 9,5-re állít juás be, és etilacetáttal újból extraháljuk. Az egyesített kivonatokat vákuumban 10 ml-re koncentráljuk, és a koncentrátumot erélyes keverés közben 100 ml dietiléter-hexán elegyhez (6:4 térf-arány) adjuk. A keletkező csapadékot kiszűrjük, kevés dietiléter-hexán eleggyel mossuk, és eldobjuk. A mosófolyadékkal egyesített szüredéket vákuumban száraz maradékká pároljuk be. Ezt a maradékot 5 ml dietiléterben feloldjuk, az oldatot leszűrjük, és keverés közben 50 ml petroléterhez (fp. 30—60 °C) adjuk. A keletkező fehértől barnáig terjedő színárnyalatú csapadékot szűrőn elválasztjuk, kevés petroléterrel mossuk, és vákuumban 40 °C-on megszárítjuk. Az így kapott antibiotikusan aktív anyag (nem tiszta 67

—694 antibiotikum) aktivitása kb. 700 /tg/mg az ismertetett vizsgálati módszerrel meghatározva. 4. példa A 67—694 antibiotikum tisztítása A 3. példa szerint kapott 67—694 antibiotikumot kloroform-metanol elegyben (9:1 tér fogatarány) oldjuk, és a kapott oldatot 250 g kovasavat tartalmazó oszlopra visszük fel. Az oszlopot kloroform-metanol eleggyel (8:1 térfogatarány) eluáljuk, miközben 0,5 ml/min kicsepegési sebességgel 5 ml-es frakciókat gyűjtünk. Minden egyes frakcióból mintát veszünk, és annak egy részét Staphylococcus aureus-szal megvizsgáljuk. Egy másik részét 250 fi vastag kovasavgél-GF-lemezeken kromatograf áljuk. A 67— —694 antibiotikumot tartalmazó frakciók R£ érr tékei kb. 0,4 és 0,5 között vannak. A frakciókat 11