161215. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a pregnán- és androsztán-sor 11 alfa-hidroxi-3-oxo-delta1,3-szteroidjainak előállítására kevert fermentációval
161215 túrák segítségével kivitelezni, amelynek során különböző mikroorganizmusokat egyidejűleg vagy egymás után használtak fel. Az utóbbi esetben a közbenső termékek izolálása nélkül a szubsztrátumot a mikroorganizmusok hatásának tették tó. A 352 33» számú svájci szabadalmi leírásban, olyan, eljágást ismertetnek, amellyel a közbenső termékek izolálása nélkül a 11,17 vagy 21 helyzetek valamelyikébe és az 1, 2 helyzetű kettős kötésre enzimek éspedig különböző gombatörzsekből származó enzimek segítségével oxigént lehet bevezetni. Az 1 050 335 számú NSZK-beli és a 2 993 839 számú USA-beli szabadalmi leírásban 11/5-helyzetű hidroxilezést ismertetnek egy gomba és 1,2-helyzetű dehidrogénezést egy baktérium segítségével, emellett mindkét folyamatot egy reakciólépésben végzik. A kevert fermentációknak azonban az a hátránya, hogy általában csak nagyon mérsékelt hozamokat eredményeznek. A gyenge hozamokat a szakirodalom arra vezeti vissza, hogy a mikrobiológiai technikában nehéz feladatot jelent egy mikroorganizmust olyan táptalajon tenyészteni, amely egy másik mikroorganizmussal már előzetesen inkubálva van. Kísérletet végeztek továbbá arra vonatkozóan is, hogy a szekunder törzsre irányuló, a primer törzs által kiváltott antagonisztikus tenyészgátló hatást megszüntessék akként, hogy a dehidrogénezést egy antibiotikum jelenlétében végzik (vö. 1 093 792 számú NSZK-beli szabadalmi leírás). Azonban az utóbbi módszer is a 33 325 számú NDK-beli szabadalmi leírás adatai szerint: „nehezen valósítható meg, mivel az egyik antibiotikum optimálisan szükséges koncentrációja analóg kísérleti adagokon belül is tág határok között ingadozik." A technika állásával ellentétben azt találtuk hogy valamely Aspergillus fajtához tartozó gomba, előnyösen az Aspergillus ochraceus és egy a Bacillus lentus fajtához tartozó baktérium, előnyösen a Bacillus lentus MB 284 ÍATCC 13 805) segítségével kevert fermentáció útján jó hozammal lehet 3-oxo-J4-szteroidokból lla-hidroxi-3-oxo-/l1 ' 4 -szteroidokat előállítani. A találmány szerinti eljárásnál meglepő módon azok az ismert műveletek is kiküszöbölhetők, amelyekkel az esetleges tenyészetgátlást vissza lehet szorítani. Ily módon sem az 1,2-helyzetben dehidráló baktérium enzimjének inhibitálása nem történik meg a jelenlevő gomba által, sem a hidroxilezési aktivitást nem befolyásolja a jelenlevő baktériumtenyészet, amelyet a hidroxilezési reakció befejezése előtt adagolunk. Figyelemre méltó továbbá a nagy dehidrálási reakciósebesség is, amely feltehetően arra vezethető vissza, hogy a szubsztrátum a hidroxilezés lezajlása után, illetve a második reakciólépés kezdetén az enzimatikus átalakuláshoz szükséges ideális oldatállapotban van. Különösen meglepőnek tekinthetők továbbá az ismert mikrobiológiai reakcióhoz képest elért magas hozamértékek, amelyek mindkét lépésben az elméleti úton számított ho^am mintegy 90%-áig terjedhetnek. A találmány szerint elért eredmény meglepő« 5 jellegét alátámasztja az is, hogy 11 ^-hidroxilezési reakcióknál és A ^helyzetben történő szubsztitúciónál a Helminthosporium sativum és Bacillus pulvif aeiens segítségével csak igen mérsékelt hozamokat sikerült elérni {vö. 2 993 839 10 száinú USA-beli szabadalmi leírás). A találmány, szerinti eljárás egyik előnye abban mutatkozik, hogy a közbenső feldolgozási műveletek kiküszöbölhetők. Ezzel a módszerrel tehát az extrakciós folyamattal együtt járó 15 anyagveszteségek is elkerülhetők. A találmány szerinti eljárás lényegét összefoglalva tehát egy új mikrobiológiai eljárást dolgoztunk ki pregnán- és ándrosztán-sorbelr lla-hidroxi-S-oxo-zl^-szteroidok előállítására 20 kevert fermentáció segítségével, amely azzal jellemezhető, hogy egy megfelelő 3-oxo-zJ4 -szterotdot egy Aspergillus fajtához tartozó gombával lla-helyzetben hidroxilezünk és a hidroxilezési reakció befejezése előtt vagy azt követően a 25 fermentációs terméket a Bacillus lentus fajtához tartozó egyik baktérium segítségével 1,2-helyzetben dehidrogénezzük. A találmány szerinti eljárásnál kiindulóanyagként használt 3-oxo-zl4 -szteroidok a pregnán- és androsztán-sorba tartozhatnak. így pl. olyan pregnán-származékokból indulunk ki, amelyek 17-helyzetben a progeszteron-, hidroxiprogeszteron-, dezoxikortikoszteron- vagy Reichstein-S-oldalláncot tartalmazzák, emellett a nevezett oldalláncok hidroxil-csoportjai funkciós származékok alakjában, pl. mint acetálok vagy mint bisz-metiléndioxi-csoportok lehetnek jelen. A megfelelő kiindulási anyagok az androsztán-40 származékokból is választhatók, amelyek 17-helyzetben egy keto-, hidroxil-, aciloxi- vagy egy 17a-alkil-17/?-hidroxi- vagy 17/?-aciloxi-csoportot tartalmaznak. Emellett a 6-helyzetben szubsztituensként fluor-, klór- vagy metü-cso-45 port, a 16-helyzetben metil- vagy metilén-csoport, a 17a- vagy 21-helyzetben fluor-csoport lehet jelen. A mikrobiológiai átalakítási reakció a technika állása szerint jól ismert módszerekkel kivitelez-50 hető. Ennek megfelelően az általában szokásos előkísérletekben meghatározzuk az aerob vagy süllyesztett tenyésztési módszer legelőnyösebb reakciófeltételeit. Az oldat vagy szuszpenzió alakban beadagolt szubsztrátum átalakulását a 55 reakció közben kivett minták extraktumaiból vékonyréteges-kromatográfiás analízis segítségével határozzuk meg. A fermentáció lezailása után a terméket valamely alkalmas és vízzel nem elegyedő oldószerrel a táptalaiból extra-60 háljuk és a kivonatból pl. bepárlással és ismert tisztítási műveletekkel, mint pl. átkristályosítással és/vagy szilikagélen történő kromatografálással az izolált terméket tisztítiuk. A legnagyobb hozam elérése céljából a fermentációt 65 egy meghatározott pH-értéken, előnyösen 6,2^ 35 2
