161173. lajstromszámú szabadalom • Eljárás inzulin-származékok előállítására
161173 19 20 b) 0,15 mólos vizes nátriumklorid-oldatban, pH= 8,5: A E l0// ° X10 3 262 millimikronnál = — 4 1 cm 220 millimikronnál = —205 5 208 millimikronnál = —280 195 millimikronnál = +622 A görbén kb. 220 millimikronnál fellépő inflexió azt jelzi, hogy a termék a természetes inzuliné- 10 hoz hasonló, részben helikoidális szerkezettel rendelkezik. Tudomásunk szerint ezt a vegyületet a szakirodalomban eddig nem ismertették. A glicin NA1 , a fenilalanin N BÍ és a lizin N« B29 15 amino-csoportja oxoenamin-f ormában történő blokkolásának ellenőrzése N-diaminonaftalinszulfonálással [B.S. Hartley és V. Massey, Biochim. Biophys. Acta 21, 58 (1956); W.R. Gray és B.S. Hartley, Biochem. J. 89, 59 (1963)]: 20 A terméket vizes hidrogénkarbonát-oldatban oldjuk, az oldathoz diaminonaftalinszulfonilklorid acetonos oldatát adjuk, és az elegyet 20 órán át 20 C°-on tartjuk. Az elegyet ezután dialízisnek vetjük alá, majd vákuumban szárazra pároljuk. 23 A maradékot 6 n sósavoldattal 17 órán át 100 C°-on hidrolizáljuk, és a hidrolizátumot Merck gyártmányú szilikagél vékonyrétegen kromatografáljuk. Oldószerként 45:35:20 arányú metilacetát — izopropanol — ammónia elegyet alkal- 30 mázunk, és az előhívást ultraibolya fényben fluoreszceinnel végezzük. A következő vegyületeket mutathatjuk- ki: 5%-nál kisebb mennyiségű NeDNS-lizin, ugyanakkor N-DNS-glicin és NDNS-fenilalanin nem mutatható ki. Hä a termé- 35 szetes inzulinnal hajtjuk végre a fent ismertetett vizsgálatot, mind a három komponens élesen megjelenik. 3. példa 40 (IV) általános képletű vegyület (ahol Z és R metü-csoportot jelent) hidrokloridjának előállítása a (IX) képletű vegyület káliumsójából. A kiindulási anyag vízben oldódik, a végtermék disszociált, vagy gyengén asszociált állapotban 45 van jelen. 2,489 g, a 2. példa D. lépésében kapott (IX) képletű vegyületet 30 ml vízben oldunk. A kb. 9 pH-értékű oldatot 1 n sósavoldattal pH=5,2 értékre 50 savanyítjuk, majd az elegyet szobahőmérsékleten centrifugáljuk, a felső folyadékréteget elöntjük, a csapadékot vízzel mossuk és ismét centrifugáljuk. A centrifugálási maradékhoz 12,1 ml vizet, 124 ml fenolt és 4,1 ml 1 n vizes sósavoldatot 55 adunk. A kapott oldat pH-értéke 1. Az elegyet 3 ótSn át 25 C°-on keverjük, majd szűrjük, az elegyhez 1650 ml acetont adunk, centrifugáljuk, a maradékot acetonnal, majd éterrel mossuk, nitrogénáramban szárítjuk, végül éjszakán át vá- 60 kuumban szárítjuk. 2 g (> 83%) színtelen, por alakú, vízben oldódó, oldatban disszociált vagy gyengén asszociált állapotban jelenlevő, a szerves oldószerek többségében oldhatatlan (X) képletű vegyületet kapunk. 65 Elemzés: Összegképlet: C2 5 9 H 387 0 75 N 65 S 6 Cl e = 6016,33 Klórtartalom: 4,2% (elméleti érték: 3,5%) Súlyveszteség vákuumban, 100 C°-on: 5,6% Ultraibolya spektrum: a) 0,15 mólos vizes nátriumklorid-oldat és 0,1 n vizes nátriumhidroxid-oldat el egyében (az elegy klorid-ion koncentrációja 0,003 n): 1% Maximum 235 millimikronnál Ej = 105 Maximum 292 millimikronnál E 10/o _ 9R9 1 cm - 26 ' 2 b) 0,1 n vizes sósavoldatban (az elegy a meghatározás előtt kb. 15 percig 20 C°-on áll): Inflexió kb. 272—273 millimikronnál Ef/o = 14 > 6 1 cm Maximum 277 millimikronnál W; '° = 15 > 8 Inflexió } cm kb. 283—284 millimikronnál E j '° = 13 ^ Maximum * cm 307—308 millimikronnál E* '° = 9 > 4 1 cm Az ultraibolya spektrum alapján megállapíthatjuk, hogy oxoen-amin-csoport nincs jelen, és a molekula pirimidinil-csoportot tartalmaz. Cirkuláris dichroizmus: a) 0,15 mólos vizes nátriumklorid-oldat és 0,003 n vizes nátriumhidroxid-oldat elegyében (pH = 10,9): 1% AEÍ 'cm X 103 219 ~ 220 millimikronnál = 277 206—207 millimikronnál = — 431 193 millimikronnál = + 493 b) 0,1 n vizes sósavoldatban (pH = 2): AE J '°m X 103 272 220 208 195 millimikronnál = — 4,98 millimikronnál = — 204 millimikronnál = — 261 millimikronnál = + 535 Tudomásunk szerint ezt a vegyületet a szakirodalomban eddig még nem írták le. 4. példa (X) képletű vegyület hidrokloridjának előállítása a (IX) képletű vegyület káliumsójából. A kiindulási anyag erősen asszociált, vízben oldhatatlan molekula-aggregátumokat képez, a végtermék oldatban disszociált, vagy gyengén aszszociált állapotban van jelen. 600 mg, a 2. példa C. lépésében előállított vegyületet [a (IX) képletű vegyület káliumsója] 40 ml 75:25 arányú, pH = 0,5 értékű fenol —0,1 n vizes sósavoldat elegyben oldunk, az oldathoz pH = 2 érték eléréséig 1 n vizes sósavoldatot adunk, és az elegyet közömbös gáz átáramoltatása közben 3 órán át 25 C°-on keverjük. Az elegyet szűrjük, 400 ml acetont adunk hozzá, a csapadékot 15 percig ülepedni hagyjuk, majd a felső folyadékréteg főtömegét eltávolítjuk. A maradékot centrifugáljuk, a-csapadékot acetonnal, majd éterrel mossuk, nitrogénáramban szárítjuk, végül szobahőmérsékleten vákuumban szárítjuk. 547 mg (91%) fehér, porszerű, vízben oldódó, szerves oldószerekben oldhatatlan terméket ka-10
