161173. lajstromszámú szabadalom • Eljárás inzulin-származékok előállítására

161173 inzulin szerkezetét. A kapott (III) általános képletű vegyület vízben nem oldódik, és erősen asszociált molekula-aggregátumokat képez. A kohéziót hidrogén-hidak, nem-kovalens kötések, Van der Waals-erőkön alapuló hidrofob kötések, és a poláris csoportok közötti elektrosztatikus erők összhatása biztosítja. Meglepő módon azt tapasztaltuk, hogy a (III) általános képletű vegyületek erős aggregációja reverzibilis állapot. Azt tapasztaltuk, ugyanis, hogy alkálifémhidroxidok jelenlétében, pH~8 értéken, fenol vagy helyettesített fenol-származékok hatására a (III) általános képletű vegyületek molekula-aggregátumai felbomlanak, és a természetes inzulinhoz hasonló mértékben diszszociált vagy gyengén asszociált, vízben oldódó (IA) általános képletű alkálifémsók képződnek. Az (IA) általános képletű vegyületek cirkuláris dichroizmus-görbéjén kb. 220 m^-nál negatív maximum jelenik meg, amely a kiindulási inzulin részleges helikoidális szerkezetére jellemző. A (III) általános képletű vegyületek disszociációja pH~8 értéken megy végbe. A megfelelő pH-érték biztosítása érdekében a reakcióelegyhez kismennyiségű alkálifémhidroxidot adunk. 70:20:5 arányú fenol:víz:l n vizes káliumhidroxid-oldat jelenlétében, 20—25 C°-on a disszociáció általában kb. 15 perc alatt végbemegy. A kapott (IA) általános képletű vegyületet ezután vízzel elegyedő szerves oldószerrel, pl. acetonnal kicsapjuk, és a képződött csapadékot centrifugálással azonnal elkülönítjük. A kapott (IA) általános képletű vegyületek elméletileg alkálifém-hexasók, a gyakorlatban azonban az elméleti értéknél nagyobb vagy kisebb mennyiségű alkálifémet tartalmaznak. A vegyületek vízben igen jól oldódnak, és hasonlóan nagymértékben oldhatók fiziológiás szérumokban is, ennek megfelelően gyógyászati célokra igen előnyösen használhatók fel. Az (IA) általános képletű vegyületek igen kis mértékben asszociálnak. Valószínű, hogy az aszszociátumokat csak néhány molekula építi fel, vagy a termék teljesen szabad, nem-asszociált molekulákból áll. Az (IA) általános képletű vegyületek asszociációfokát — amely több tényező, így az oldószer pH-értéke, az oldat koncentrációja stb. függvénye — jelenleg nem ismerjük pontosan. Elméleti jellegű feltevéseink a találmány oltalmi körét nem korlátozzák. Az (IA) általános képletű vegyületek aminocsoportjait és guanidil-csoportját egyaránt Z— CO—CH2—

CO—R általános képletű ß-aiketon blokkolja. Ha olyan (I) általános képletű vegyületeket kívánunk előállítani, amelyekben az aminő-csoportokat a Z—CO—CH2—CO—R általános képletű /J-diketontól eltérő X—CO—CH2— CO—Y általános képletű /?-diketon blokkolja, az (IA) általános képletű vegyületeket — előnyösen fenol vagy helyettesített fenol-származék jelenlétében — enyhe savas hidrolízisnek vetjük alá, majd a kapott (IV) általános képletű vegyületet enyhén savas vagy enyhén lúgos közegben X— CO—CH2—

CO—Y általános képletű /?-diketonnal reagáltatjuk. Az (IA) általános képletű vegyületek hidrolízisét általában 75% fenolt és 25% 0,1 n vizes sósavoldatot tartalmazó közegben hajtjuk végre. A fenti körülmények között 20—25 C°-on az 5 oxoenamino-csoportok hidrolízise néhány óra alatt végetér, a guanidil-csoport azonban nem válik szabaddá. A gyakorlatban rendszerint úgy járunk el, hogy a (IV) általános képletű vegyületeket egy 10 lépésben állítjuk elő a (III) általános képletű vegyületekből. A reakciót 75% fenolt és 25% 0,1 n vizes sósavoldatot tartalmazó közegben, 20—25 C°-on, pH = 1—2 értéken hajtjuk végre. A reakció során a disszociáció és a hidrolízis egy lé-15 pésben megy végbe, és a reakció néhány óra alatt végetér. Ha az (IA) általános képletű vegyületek elemzése során a szulfáthamu mennyisége meghaladja a 10%-ot, a további reakciók előít az ásvá-20 nyi sókat el kell távolítani. Az ásványi sók eltávolítása érdekében az (IA) általános képletű vegyületet vízben oldjuk, majd izoelektromos pontján (pH = 5,3) kicsapjuk és vízzel többször mossuk. A nedves csapadékot ezután fenol és híg 25 vizes sósavoldat elegyével hidrolizáljuk. A (IV) általános képletű vegyületek sóit egyszerű eljárással alakíthatjuk vízben oldódó szervetlen vagy szerves bázisokkal képzett sókká, előnyösen alkálifémsókká, pl. káliumsóvá. A ká-30 liumsó előállítása során pl. úgy járunk el, hogy az [N (5-pirimidinil-ornitin B22]-inzulin-hidroklorid vizes oldatának pH-értékét káliumhidroxiddal az izoelektromos pontra (pH = 5,2) állítjuk, a kivált szabad [N á-pirimidinil-ornitin-35 B22]-inzulint centrifugálással elkülönítjük, 75:20:5 arányú fenol:víz:l n vizes káliumhidroxid-oldat elegyével kezeljük, és a képződött káliumsót acetonnal kicsapjuk. Hasonló módon állítjuk elő az [N <S-pirimidinil-ornitin B22]-in-40 zulin egyéb, vízben oldható sóit is. A szabad fehérje előállítása során a vegyületet a só vizes oldatából pH = 5,2 értéken kicsapjuk, a terméket mossuk, centrifugáljuk és szárítjuk. A szabad [N á-pirimidinil-ornitin B22]-inzulint, 45 ül. szerves vagy szervetlen bázisokkal — előnyösen alkálifém-bázisokkal — képezett, vízben oldódó sóit a korábbiakban ismertetett módon X—CO—CH2—

CO—Y általános képletű ß-diketonokkal kondenzáltathatjuk. A reakció során 50 (V) általános képletű vegyületeket kapunk. A (IV) általános képletű sók és az X—CO— CH2—CO—Y általános képletű /?-diketonok kondenzációját vizes, homogén vagy heterogén, gyengén savas vagy gyengén lúgos közegben, kis-55 mennyiségű alkohol jelenlétében hajtjuk végre. Az [N ő-dimetil-4,6-pirimidinil-2-ornitin B22]-inzulin és metil-5-hexán-dion-2,4 kondenzációját pH~8 értéken hajtjuk végre. A kiindulási anyag sóját — pl. az [N ő-dimetil-4,6-pirimidinil-2-or-60 nitin B22]-inzulin-hidrokloridot metil-5-hexán-dion-2,4, etanol és a megfelelő kémhatás (pH = 8) biztosításához szükséges mennyiségű káliumhidrogénkarbonát vizes oldatában oldjuk, és az elegyet 7 napig 20 C°-on keverjük. Az ásványi só-65 szennyezéseket dialízissel elkülönítjük majd a 4