161104. lajstromszámú szabadalom • Eljárás dez-fenilalanin B1-inzulin előállítására
3 -lihidrogénkarbonát- vagy alkálifoszfát-pufferelegyet alkalmazhatunk. A reakciót kb. 50 C°-on is végrehajthatjuk, előnyösen azonban kb. 35— 40 C°-on dolgozunk. A reakció szobahőmérsékleten is végbemegy, ekkor azonban a reakció időigénye 4—6-szorosára emelkedik. A di-terc. butiloxikarbonil-inzulin közbenső terméket éteres kicsapással is elkülöníthetjük, eljárhatunk azonban úgy is, hogy az oldatot vákuumban, 50 C°-nál nem magasabb hőmérsékletű fürdőn szárazra pároljuk, majd a maradékot éterrel eldörzsöljük. A pufferoldatban oldott sók eltávolítása érdekében a csapadékot 5—10-széres súlymennyiségű 1—2%-os ecetsavoldattal és vízzel alaposan mossuk, majd vákuumban foszforpentoxid fölött szárítjuk. A feniltiokarbamoil-vegyületet a következőképpen állítjuk elő: az előző lépésben kapott terméket előnyösen kb. 20—50-szörös mennyiségű, kb. 60—95%-os — előnyösen 80—95%-os — vizes piridinben oldjuk, és az oldathoz 1,5— 4 mmól, adott esetben helyettesített fenilmustárolajat adunk. Oldószerként piridin helyett dimetilformamidot is alkalmazhatunk. A fenilmustárolaj szubsztituensei negatív töltésű csoportok lehetnek, pl. klór-, nitro- vagy trifluormetil-gyök. Az elegyet 3—20 órán át — előnyösen 3—6 órán át — szobahőmérsékleten keverjük. A reakciót előnyösen a zavarosodás fellépésekor fejezzük be (a zavarosodás a termékek denaturálódásának kezdetét jelzi). A reakciót kb. 40 C°-on, ill. 0—10 C°-on is végrehajthatjuk, ekkor azonban a reakcióidőt megfelelően növelnünk, ill. csökkentenünk kell. A reakció lezajlása után a terméket éterrel kicsapjuk, a csapadékhoz kb. 10-szeres súlymenynyiségű trifluorecetsavat adunk, az elegyet 1—2 órán át állni hagyjuk, majd a terméket éterrel kicsapjuk, és ismert módon, 5,0—5,5 pH-értéken kristályosítjuk. A termék aminosav-elemzési adatai megfelelnek a várt összetételnek. A glutaminsavra vonatkoztatott aminosav-elemzési adatokat az alábbiakban közöljük: Glu Számított: 7 Talált: 7,00 Gly Számított: 4 Talált: 3,98 Phe Számított: 2 Talált: 2,06 Lys Számított: 1 Talált: 1,01 A találmány szerinti eljárással előállított dezfenilalaninB1 -inzulin sajátságai megegyeznek az ismert módszerekkel előállított vegyületével. E vegyület a gyógyászatban igen előnyösen használható fel antidiabetikumként; a vegyület gyógyászati előnyei az inzulintól eltérő fizikai sajátságokon — pl. eltérő oldhatósági viszonyokon — alapulnak. A találmány szerinti eljárást az oltalmi kör korlátozása nélkül az alábbi példákban részletesen ismertetjük. Az acilezett inzulin jellemzésére az papírelektroforézis adatait közöljük; a vizsgálatot ecetsav és hangyasav elegyében, pH = 2 értéken, 200 Volt feszültségen 6 órán át végeztük, színezékként brómfenolkéket alkalmaztunk. A fenilalanín lehasadását elektroforézissel és aminosav-elemzéssel ellenőriztük. 4 1. példa: a) 1 g (0,167 mmól) sertés-inzulint 70 ml 80%-os dimetil-acetamiddal elegyítünk. Az elegy-5 hez 1,45 g (10 mmól) terc. butiloxikarbonil-azidot és 3,3 ml (3,3 mmól) 1 n nátriumhidrogénkarbonát-oldatot adunk, és 5 órán át 35 C°-on keverjük. Az oldatot vákuumban, legfeljebb 50 C°-os fürdőn bepároljuk. A maradékot éterrel eldör-10 zsöljük, és a kapott 1,275 g, sótartalmú elegyet 20 ml 2%-os ecetsavoldattal mossuk. 945 mg N a(A1) , N e <B29 > -di-terc. butiloxikarbonil-inzulint (sertés) kapunk. b) Az a) lépésben kapott terméket 4 ml 95 15 %-os piridinben oldjuk. Az oldathoz 0,0365 ml fenilizotiocianátot adunk, és 4 órán át szobahőmérsékleten keverjük. Az elegyet vákuumban, legföljebb 50 C°-os fürdőn, kis térfogatra bepároljuk, és a terméket éterrel kicsapjuk. 820 mg 20 N «<A1 >, N £<B29 >-di-terc. butiloxikarbonil-N «< B1 > -feniltiokarbamoil-inzulint (sertés) kapunk. c) 820 mg, a b) lépésben kapott termék és 8,5 ml trifluorecetsav elegyét 1 órán át szobahőmérsékleten állni hagyjuk, majd az elegyhez 100 ml 25 étert adunk. A kapott 720 mg dez-fenilalanin B1 inzulint (sertés) ismert módon, 5,0—5,5 pH-értéken kristályosítjuk. A trifluorecetsavas kezelést 50 C°-on, ill. visszafolyatás közben is végrehajthatjuk, ekkor a reakció 10 percet, ill. 5 percet 30 vesz igénybe. Aminosavelemzés adatai: Phe Számított: 2,00 Talált: 2,06 2. példa: 1 g szarvasmarha-inzulint az 1. példában megadott módon kezelünk. 710 mg dez-fenilalaninB1 -inzulint (szarvasmarha) kapunk. Aminosavelemzés: Phe Számított: 2,00 Talált: 2,05 3. példa: 1 g szarvasmarha-inzulint az 1. példában ismertetett módon kezelünk azzal a különbséggel, hogy a b) lépést 85%-os piridinben, +5 C°-on, hajtjuk végre. A b) reakció 50 órát vesz igénybe. 695 mg dez-fenilalaninB1 -inzulint (szarvasmarha) kapunk. Aminosavelemzés: Phe Számított: 2,00 Talált: 2,06 4. példa: 1 g sertés-inzulint az 1. példában ismertetett 60 módon kezelünk azzal a különbséggel, hogy a b) lépésben az elegyet 1 órán át 40 C°-on tartjuk. 725 mg dez-fenilalaninB1 -inzulint (sertés) kapunk. Aminosavelemzés: 65 Phe Számított: 2,00 Talált: 2,03 2
