161104. lajstromszámú szabadalom • Eljárás dez-fenilalanin B1-inzulin előállítására
MAGYAR NÉPKÖZTÁRSASÁG ORSZÁGOS TALÁLMÁNYI HIVATAL SZABADALMI LEÍRÁS Bejelentés napja: 1971. II. 6. (HO—1350) Német Szövetségi Köztársaságbeli elsőbbsége: 1970. II. 7. (P 20 05 658.0) Közzététel napja: 1972. II. 28. Megjelent: 1972. X. 30. 161104 Nemzetközi osztály: A 61 k 17/02; C 07 c 103/52. / 9. -'Jl » :• \ Feltaláló: Dr. Geiger Rolf vegyész, Frankfurt/Main, Német Szövetségi Köztársaság Tulajdonos: Farbwerke Hoechst Aktiengesellschaft, vormals Meister Lucius und Brüning, Frankfurt/Main, Német Szövetségi Köztársaság Eljárás dez-fenilalaninB1 -inzulin előállítására A találmány tárgya eljárás dez-fenilalaninB1 inzulin előállítására, azzal jellemezve, hogy az inzulint, összesen 3—6 szénatomot tartalmazó N, N'-dialkilkarbonsavamid és 8,0—9,0 pH-értékű vizes pufferoldat elegyeben, szobahőmérsékleten 5 vagy kissé megnövelt hőmérsékleten fölös menynyiségű terc. butiloxikarbonil-aziddal reagáltatjuk, majd 2—4 ekvivalens, helyettesítetlen, vagy negatív töltésű helyettesítőt hordozó fenilizotiocianáttal reagáltatjuk, és a terméket erős savval, 10 pl. trifluorecetsavval kezeljük. Az ismert eljárás szemit a dez-fenilalaninB1 inzulint fluoreszcein- vagy fenil-tiokarbamoilB1 inzulinból állították elő Edman-lebontással. Az inzulin és izotiocianátok tiokarbamoil-vegyületek 15 képződéséhez vezető reakciója során azonban — tekintettel arra, hogy a jelenlevő három aminocsoport különböző mértékben reagál — különféle termékek elegye képződik, amelyeket csak nehézkes műveletekkel, pl. 8 mólos karbamiddal 2 o végzett oszlopkromatografálással vagy gél-elektroforézissel lehet elkülöníteni egymástól. Ezt az elválasztást csak kis anyagmennyiségekkel lehet végrehajtani, ezért ezt a módszert eddig csak analitikai célokra alkalmazták. 25 A találmány szerinti eljárás legfontosabb előnye, hogy nagyobb anyagmennyiségekkel is igen egyszerűen végrehajtható. A terc. butiloxikarbonil-azid és inzulin reakciója során, a találmány szerinti eljárásban al- 30 kalmazott körülmények között meglepő módon túlnyomó többségében N a(A1) , N e'^'-diterc. butiloxikarbonil-inzulin képződik, amelynek a fenilalaninB1 -részéhez kapcsolódó szabad aminocsoportját a következő lépésben fenilizotiocianáttal reagáltatjuk. Ez a reakció teljesen szelektíven megy végbe. A kapott terméket ezután erős savval, előnyösen trifluorecetsavval kezeljük. Az utóbbi reakció során a két terc. butiloxikarbonil-csoport kilépésével egyidőben a fenilalaninB1 -csoport is lehasad tiazolinon formájában. Kiindulási anyagként bármilyen eredetű inzulint felhasználhatunk, előnyösen azonban szarvasmarha- vagy sertésinzulint, ill. e két inzulinfajta tetszés szerinti arányú elegyét alkalmazzuk. A találmány szerinti eljárást pl. a következőképpen hajthatjuk végre: 1 mmól inzulint 30— 70-szeres mennyiségű, adott esetben legfeljebb 25% vizet tartalmazó N, N'-dialkil-karbonsavamidban szuszpendálunk, ill. oldunk. Dialkilkarbonsavamidként pl. dimetilformamidot, dimetilacetamidot, dietilformamidot vagy N-metilpirrolidont alkalmazhatunk. A reakcióelegyhez ezután 20—75 mmól terc. butiloxikarbonil-azidot, és a bemért inzulin súlyára számított 2,5—4-szeres térfogatú pufferoldatot adunk, és az elegyet 3—6 órán át kb. 35—40 C°-on keverjük. Pufferoldatként pl. 8,0—9,0 pH-értékű 1 n alká-161104
