161093. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gentamicin C komplex és paromomicin előállítására
11 161093 12 Térfogat Paromomicin Gentamicin liter mg/ml mg/ml 1. 5,2 118,0 1,04 2. 5,1 24,0 5,45 Az 1. eluátumot vákuumban maximum 75 C°-on 1/10 térfogatra pároljuk be, majd 5 liter ammónium-formájú Wofatit CP—300 gyantát tartalmazó oszlopon (átmérő: 8 cm, gyantaágy magassága: 100 cm) kötjük meg. A gyantaágyat 10 liter 0,05 n ammóniumhidroxiddal átmossuk, majd 0,1 liter/óra sebességgel eluáljuk 0,15 n ammóniumhidroxiddal. 500 ml-es frakciókat gyűjtünk és a paromomicint tartalmazó 4—12. frakciókat egyesítjük, majd vákuumban szirupsűrűségig bepároljuk. A szirupos maradékhoz 5 liter acetoriíb adunk, a keletkezett paromomicin bázist üvegszűrőn megszűrjük, acetonnal mossuk és vákuumban súlyállandóságig szárítjuk. Így 421 g 980 mcg/mg tisztaságú paromomicin bázist kapunk. Analízise: C: 44,63%, H: 8,11%, N: 10,57%, hamutartalma: 0,1%. Optikai forgatóképessége: (ot)20 D = +60,3° (1%, víz). Papír- és rétegkromatográfiás viselkedése megegyezik az autentikus paromomicin viselkedésével és az irodalmi adatokkal. A 2. eluátumot vákuumban maximum 75 C°on 1/10 térfogatra pároljuk be, majd a kapott oldatot 6 liter Dowex—1X2 (OH) gyantát tartalmazó oszlopra (átmérő: 9 cm, gyantaágy magassága: 94 cm) visszük. A gyantaágyról az antibiotikumokat desztillált vízzel oldjuk le 0,3 liter/óra sebességgel: összesen 12 db 1000 ml-es frakciót szedünk. A kromatográfiás adatok alapján az 1—4. frakciók gyakorlatilag csak gentamicint tartalmaznak. Ezeket egyesítjük, és vákuumban szárazra pároljuk. Így 20,35 g 975 mcg/ml tisztaságú gentamicin bázist kapunk. Analízis: C: 49,29%, H: 8,80%, N: 13,50%, hamutartalma: 0,2%. Optikai forgatóképessége: (a)20 D = +137° (1%, víz). Papír- és rétegkromatográfiás viselkedése megegyezik az autentikus gentamicin viselkedésével és az irodalmi adatokkal. (J. Chromat. 30, 572 [1967], J. Antibiot. 17, 218 [1964]). 2. példa 15 liter erjesztéses oldat pH-ját (1080 mcg/ml paromomicin, 78 mcg/ml gentamicin) oxálsavval 3,0-ra állítjuk, majd az elegyet megszűrjük. A kapott szűrlet pH-ját 25%-os ammóniumhidroxiddal 8,0-ra állítjuk, és az így kapott oldatot 1 db 200 ml Amberlite—CG—50—I ammóniumformájú gyantaoszlopon 1 liter/óra sebességgel átfolyatva megkötjük. A gyantaágyat ezután először 500 ml desztillált vízzel, majd 500 ml 0,08 n ammóniumhidroxiddal átmossuk. A megkötött antibiotikumokat ezután ammóniumhidroxidos gradiens elucióval leoldjuk. A leoldás kezdetén az ammóniumhidroxid koncentrá-5 ciója 0,1 n, a befejezéskor 0,6 n. A leoldás sebessége 50 ml/óra. 50 ml-es frakciókat gyűjtve azt találjuk, hogy a 4—6 frakciók gyakorlatilag csupán paromomicint (83 000 mcg/ml), a 7-es frakció paromomicint és gentamicint, míg a 8^— 10 9-es frakciók gyakorlatilag csak gentamicint (8100 mcg/ml) tartalmaznak. A 4—6-os frakciókat egyesítve vákuumban mintegy 30—40 ml térfogatra bepárolva a ka-15 pott oldatot, 250 ml Dowex—1X2 (OH) (200— 400 mesh) gyantát tartalmazó oszlopra visszük, majd 30 ml/óra sebességgel ionmentes desztillált vízzel eluáljuk. 25 ml-es frakciókat szedve azt tapasztaljuk, hogy az 5. frakciótól kezdve az 20 eluátum már csupán paromomicint tartalmaz (mégpedig az 5. frakció elsősorban paromomicin II-t, és a 6—9-es frakciók elsősorban paromomicin I-t). Az 5—9-es frakciókat egyesítjük, majd vákuumban szirupsűrűségig bepároljuk, és a ka-25 pott szirupot 50 ml acetonnal eldörzsöljük. A paromomicint üvegszűrőn leszűrjük, acetonnal mossuk. Így 8,52 g 970 mcg/mg tisztaságú paromomicin bázist kapunk. 30 Analízise: C: 44,7%, H: 8,0%, N: 10,6%, hamutartalma : 0%. Optikai forgatóképessége: («)20 D = +62° (1%, víz). A gradiens elucionál kapott 8—9-es frakció-35 kat (0,4—0,5 n NH4 OH) egyesítve vákuumban kb. 5 ml térfogatra bepároljuk, majd az oldatot 50 ml Dowex—1X2 (OH) (200—400 mesh) gyantát tartalmazó oszlopra visszük, majd 10 ml/óra sebességgel ionmentes vízzel eluáljuk. 10—40 40 ml-es frakciókat szedve azt tapasztaljuk, hogy a 2—4-es frakciók csupán gentamicint tartalmaznakj az 5-ös frakcióban pedig papírkromatográfiás vizsgálattal csekély mennyiségű paromomicin (25 mcg/ml) mutatható ki. A 2—4 frak-45 ciókat vákuumban csaknem szárazra pároljuk, 20 ml acetonnal eldörzsöljük, leszűrjük és 10 ml acetonnal megmossuk. Így 0,58 g gentamicin bázist kapunk. Tisztasága 980 mcg/ml, nitrogéntartalma 13,67%. 50 Szabadalmi igénypontok: 1. Eljárás gentamicin C komplex és paromomicin előállítására mikrobiológiai úton, azzal 55 jellemezve, hogy a Streptomyces longisporoflavus S—244 sugárgomba törzset (letétbe helyezve 64/1971. sz. alatt 1971. március 11-én az Országos Közegészségügyi Intézetben) komplex fehérjét, szénhidrátot és ásványi sókat tartalmazó 60 táptalajon aerob körülmények között 22—40 C°-on, célszerűen 28 C°-on tenyésztjük, majd a tenyészetből a keletkezett antibiotikumok elegyét kivonjuk, és az elegyből a gentamicin C komplexet és a paromomicint egymástól elkülö'65 nítjük. 6
