161092. lajstromszámú szabadalom • Eljárás oligomicin A előállítására
5 161092 6 jávai egy 500 ml-es Erlenmeyer lombikban beoltunk 100 ml alábbi összetételű inokulum táptalajt: Szójaliszt 2,0% Kukoricalekvár 50% szárazanyagtart.) 0,2% Kazein-hidrolizátum (10% kazein) 1,0% Glükóz 3,0% NaCl 0,3% Co(N03 ) 2 0,001% A tenyészetet 28 C°-on, 48 órán át síkrázógépen rázzuk, majd beoltjuk vele az 50 liter hasznos térfogatú üzemi fermentort, ahol további 48 órán keresztül fermentálunk, majd 15 literével beoltjuk a 100 liter hasznos térfogatú főfermentort. A főfermentáció táptalajának összetétele: Szójaliszt 2,0'% Kukoricalekvár (50% szárazanyagtart.) 0,2% Kazein-hidrolizátum (10% kazein) 1,0% Glükóz 3,% NaCl 0,3% CaCOs 0,3% Co(N03 ) 2 0,002% pH 7,0—7,2 starilezés előtt, fordulatszám 260— 520/perc. Az átáramoltatott levegő mennyisége 50—25/1/perc. Habgátlóként polipropilénglikolt vagy pálmaolajat alkalmazunk. Hőmérséklet: 26—30 C°. A mikroszkópi képben a 36. órában erős növekedés figyelhető meg, ami az 55—60. órában éri el a maximumot. A 48—60. órában a hőmérsékletet 30 C°-ról 26 C°-ra csökkentjük, a cukorbomlás sebességét a fordulatszám, ill. az átáramoltatott levegőmennyiség változtatásával szabályozzuk oly módon, hogy a termelőszakasz kezdetén az 1,1—1,3 mM CVVperc szulfitoxidáeiós értéket 0,4—4,5-re csökkentjük. Ilyen módon a pH nem csökken 6,8 alá. Fenti feltételek mellett a 125—130. órában 280 /íg/iml oligomicin A koncentráció érhető el. Ekkor leállunk és az antibiotikumot a micéliumról izoláljuk. Az antibiotikum koncentráció meghatározását biológiai értékméréssel, Aspergillus niger-rel és Glomerella cingulata-val szemben végezzük a szokásos módon (11). b) Izolálás A fenti erjesztéses oldat 50 literének (280 /^g/ml) pH-ját szilárd oxálsavval vagy telített oxálsav-oldattal keverés közben pH = 3—4-re állítjuk be, majd a micéliumot szűréssel vagy centrifugálással különítjük el az elegytől. A szűrletet, melynek aktivitása elhanyagolhatóan alacsony (2—5 jug/ml), elöntjük. A nedves micéliumot (2,5—3 kg) kétszeres súlyú acetonnal extraháljuk keverés mellett. Az extr akció hatékonyabbá tétele érdekében célszerű egy órán át 25 C°-on végzett keverés után a micéliumot 22 órán át acetonban állni hagyni, utána ismét egy órát kevertetni, s a micéliumot csak ezután megszűrni. Az acetonos extraktum aktivitása 2620 /tg/ml. A leszűrt micélium ismételt extrakciója többnyire nem gazdaságos, mert a második extraktum hatékonysága rendszerint még az eredeti fermentlé hatékonyságát sem közelíti meg, és ezenkívül az aceton nagyon sok olajos szennyeződést kiold. Az első acetonos extraktumot (5—6 liter) csökkentett nyomáson 40 C° alatti hőmérsékleten bepároljuk, míg azt a habzás megengedi. A visszamaradt vizes maradékot (800—1000 ml) 2X800 ml, majd 1X400 ml etilacetáttal extraháljuk. Az első extraktum aktivitása 3780 /íg/ml, a másodiké 3000 /ig/ml, a harmadiké 320 jMg/ml. A háromszorosan kiextrahált vizes oldat aktivitása 3—20 ßg/ml, ezért ezt az oldatot elöntjük. Az egyesített etilacetátos extraktumokat 1% aktív szénnel kezeljük, és nátriumszulfát fölött szárítjuk. Szűrés után a szűrleteket csökkentett nyomáson 40 C° alatt bepároljuk. A visszamaradó olajos maradékot 400 ml petroléterrel extraháljuk. A ragadós, halványsárga nyers port leszűrjük. Kromatográfiásan tiszta oligomicin A nyerhető, ha a kapott nyers hatóanyagot kombinált kristályosítással előbb etanol—vízből, ezt követően metanol—vízből kristályosítjuk át. Kitermelés a fermentiere számított aktivitás 55—58%-a. Kromatográfiásan egységes anyagot nyerhetünk olyan módon is, ha az etilacetátos extraktum bepárlása után nyert olajos maradékot etanolban vesszük fel és annyi petroléterrel elegyítjük, hogy még homogén oldatunk legyen. Ezt az oldatot felvisszük 9 :,1 arányú petroléter— etanol eleggyel nedvesített szilikagél oszlopra, és ugyanezzel az oldószer eleggyel eluálunk. Az oszlop tetején adszorbeálva maradnak az olajos szennyező anyagok, míg a hatóanyag az első eluátumokban már megjelenik. Az eluátumokat 24 órán át állni hagyva, azokból kikristályosodik a hatóanyagot makacsul kísérő inaktív melléktermék (Rf = 0,3 szilikagél vékonyrétegen kromatógrafálva petroléter—etanol 94:6 rendszerben). Ezt leszűrve, az anyalúgot csökkentett nyomáson 40 C° alatt bepároljuk. Az olajos maradékot etanol—víz, ezt követően metanol—víz elegyből átkristályosítva, kromatográfiásan egységes oligomicin A-t nyerünk, amelynek R/ értéke a fenti rendszerben 0,17, tisztasága azonos az egyszerű kombinált kristályosítási eljárással nyert végtermék tisztaságával. 2. példa Streptomyces diastatochromogenes var. O3 burgonya-glükóz agárról nyert spóraszuszpenziójával egy 500 ml-es Erlenmeyer lombikban beoltunk 100 ml 1. példában leírt inokulum táptalajt. A tenyészetet 28 C°-on, 48 órán át síkrázógépen rázzuk, majd beoltjuk vele az 5 liter 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3
