160823. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a negamicin antibiotikum előállítására
160823 9 10 /t/g/ml); Shigella flexneri 12.5 /íg/ml; Salmonella typhosa 3.12 /Ág/ml, Klebsiella pneumoniae PCI 602 12.5 /tg/ml (6.25 /ig/ml); Serratia mareescens 12.5 /íg/ml (6.25 /xg/ml); Proteus vulgaris OX19 Proteus retitgeri (GN311) 12.5 /*g/ml (6.25 «g/ml); Pseudomonas aeruginosa (No. 2.) 12.5 /ig/ml; Pseudomonas aeruginosa No. 3. 25 /eg/ml (12.5 /ig/ml); Pseudomonas fluorescens 6.25 jug/ml (3.12 /tg/ml); Mycobacterium smegmatis 67 100 jug/ml. A 20 óra hosszat tenyésztett kultúra ezerszeres, 'hígításából egy oltótűnyi mennyiséggel sávot húzva, gátlóhatás figyelhető meg a fent leírt félkoncentrációknál. A gátló hatás 0,5'% peptonagár táptalajon erősebb, mint tápagáron. A következő organizmusok fejlődését a következő koncentrációkban gátolja (a zárójelben levő értékek a parciális gátlóhatás koncentrációját mutatják): S. aureus 209p 1.56 /íg/ml; S.lutea PCI 1001 5.0 jug/ml (2.5 /íg/ml); B.subtilis NRRL—B558 12.5 /íg/ml; E.coli K12 1.56 /íg/ml; E. coli NIHJ 1.56 /íg/ml;. S.flexneri 3.12 /tg/ml; K.pneumoniae PCI 602 6.25 jug/ml; (3.12 /íg/ml); S.typhosa<0.78 /*g/ml; Pr.rettgeri CN311 1.56 /íg/ml; S.maroesoens 12.5 /íg/ml (3.12 /íg/ml); Ps. aeruginosa No. 3 6.25 /tg/ml; Ps. aeruginosa No. 46 3.12 /íg/ml (1.56 ,/íg/ml); M. segmatis 607 50 /tg/ml. A C.albieans fejlődését 100 /tg/ml-nél nem gátolja. A negamicin gátló hatása szérum hozzáadásával nem csökken, így pl. E. coli fejlődését 3,12 /íg/ml negamicin gátolja minden táptalajon 0, 5, 10, 20, 40% szérumtartalomnál. A negamicin alkalikus közegben erősebb antibakteriális hatást fejt ki, így pl. E. coli-val szemben, 0,5% pepton tartalmú vízben a gátlási koncentráció különböző pH-n a következő: pH 5.0 12.5 íig/ml (3.12 /tg/ml); pH 6.0 12.5 /tg/ml); 3.12 pgf, ml pH 7.0 3.12 /<g/ml (1.56 /íg/ml); pH 8,0 1.56 /íg/ml (0,78 /íg/ml); pH 9.0 1.56 /*g/ml (0.78 ml ml). Hengeres diffúziós módszerrel 0,5% peptonagár és E. coli K12 alkalmazásával 25 //g/ml negamicin különböző pH-n a következő gátlási átmérőket mutatja: pH 6,0 16 mm; pH 7,0 20 mm; pH 8,0 21 mm. A negamicin alacsony toxicitású. Intravénás injekcióval az egerek pusztulása 400 rag/kg testsúlynál következik be. Egereiken naponta, 30 napon keresztül, intraperitoneális injekcióval 200 mg/kg testsúly mennyiséget adagolva toxikus hatás nem volt megfigyelhető. A negamicin késleltetett toxicitással sem rendelkezik. Házi nyúlba 50 mg/kg mennyiségben intramuszkuláris injekcióval adagolva magas vérkoncentrációt okoz, így 100 /íg/ml adagolás után egy órával, 24 óra időtartam alatt a vizeletben 80%ra kiürül; magas koncentrációban, pl. 1—2 órával az injekció beadása után 4480 /íg/ml van a vizeletben. Ezek az eredmények tehát bizonyítják a pozitív hatást in vivo. Bizonyítást nyert egeretken, hogy a negamicin hatásos a Pseudomonas aeruginosa No. 12, Klebsiella pneumoniae S—1802, Salmonella typhosa 63 és Staphylococcus aureus Smith S—424 fertőzésekkel szemben. Ezen fertőzések ellen a CDm 4.4, 5,0, 2.5 és 12.5 mg/ikg, ha az intraperitoineális fertőzés 10 MLD és hat órával a fertőzés után a negaimicint közvetlenül szubkután injektáljuk. A fent leírtaiknak megfelelően tehát a negamicin alacsony toxicitású antibakteriális anyag, 5 mely gátolja a gram-^pozitív és a gram-negatúr baktériumok, beleértve a Pseudomonas mikroorganizmus fejlődését is. Ez az antibiotikum könnyen megkülönböztethető az ismert antibiotikumoktól, analitikai eredményei, infravörös 10 spektruma, amfotér tulajdonsága, magas feszültségű elektroforézise és szerkezete alapján. Ezek szerint tehát az általunk felfedezett negamicin kétséget kizáróan egy új antibiotikum. Amint az anyag szerkezete mutatja, a nega-15 micin hidrolízise 1-metil-hddrazin-ecetsavat ad, mely N,N'-dimetilhidrazinná alakul át. Azt találtuk, hogy az 1-metil-hidrazin-ecetsav gátolja a glutaminsav-piruvát transzaminázt és a májra toxikus. A negamicinnek nincs ilyen toxici-20 tása, bár tekintettel a hidrolízis lehetőségére a negamicint rövid időre kellene injektálnunk a fertőzés kezelésénél. A negamicin tehát használható felületi fertőzések, mint amilyenek a bőr és a nyálkahártya fertőzése, helyi kezelésére. 25 Ezen túlmenően a negamicin használható a vele analóg anyagok szintézisére. A negamicin tulajdonságai most már ismertek és ezen tulajdonságaik, valamint a jelen találmány alapján ez az antibiotikum könnyen előa0 állítható, amint ezt az alanti példák is bizonyítják. Ennek ellenére ezek a példák a találmányt nem korlátozzák. A jelen találmány magába foglalja a találmányban leírt eljárás összes változatait. 35 1. példa Egy 500 ml-es rázólombikba beöntünk 125 ml 40 táptalajt, mely 2% glükózt, 2% keményítőt, 2% szójabablisztet, 0.5% élesztő-extraktot, 0.25% NaCl-t, 0.35% CaCOs-t, 0.0005% CuS04 .5H 2 0-t, 0.0005% MnCl2 .7H 2 Q-t és 0.0005% ZnS0 4 . 7H2 0-t tartalmaz. A pH 7.0-re történt beállítása 45 után a táptalajt 20 percig 120 C°-on sterilizáljuk. Ezt a táptalajt az M890—C2 számú törzs 2.5 ml két napon át rázott tenyészetével csíramentesen beoltjuk. Az oltótenyészet 1% glükózt, 1% keményítőt, 0.75% húsextraktot, 0.75% pep-50 tont, 0.3% NaCl-t, 0.1% MgS04.7H 2 0-t, 0.0007% CuS04 .5H 2 0-t, 0.0001% FeS0 4 .7H 2 0-t, 0.0008% MnCl2 .7H 2 0-t és 0.0002% ZnS0 4 .7H 2 Ot tartalmaz. A fermentációt 27 C°-on, öt napon át 130 löket/perc sebességgel rázva, végezzük. A fer-55 mentlevet a mioélium elválasztására centrifugáljuk és így hatvan lombikból 6000 ml szűrletet kapunk. A szűrlet 35 /íg/ml negamicint tartalmaz. A szűrletet 400 ml Amberlite IRC—50 (70% Na-forma) gyantát tartalmazó kolonnán enged-60 jük át (átmérő 30 mm). A gyantát vízzel mossuk, a negamicint 20% ammóniát tartalmazó vízzel eluáljuk. A 600 ml aktív frakciót csökkentett nyomáson betöményítjülk és így 144 ml (pH 9.4, 800 /íg/ml) koncentrált oldatot kapunk. Ezt a tö-65 meny oldatot 60 ml Dowex 1X2 (ÖH-forma) <>
