160823. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a negamicin antibiotikum előállítására
160823 5 6 termelő törzseik tulajdonságaikban kis mértékben eltérnek az ismert Str. purpeofuseus fajoktól, ezeket mégis ide soroljak. Hasonlóképp bebizonyítottuk, hogy. a Str. purpeofuseus (ISP 5283) típusú kultúra szintén termel negarnicint. Az antibiotikumok termelése Str. purpeofuseus Yamaguchi és Saburi-val az irodalomból ismert (J. of Generla and Applied Microbiology, 1, 201 — 234, 1955), mely szerint a tenyészet szűrlete a Trichomonas-szal, gram pozitív és savtűrő baktériumokkal szemben gátló (hatást fejt ki. A gram negatív baktériumokkal szemben.aktív antibiotikumok előállítását azonban nem írták le. Következésképp, bér a Str. purpeofuseus ismert faj, a negamicin termelését a jelen találmány felismeréséig még sohasem figyelték meg. Amint ez ismert, a Streptomyces faj általában nem stabil és így mesterséges vagy természetes körülmények 'között könnyen képez mutánsokat és variánsokat. A jelen találmány magába foglalja a Streptomyces purpeofuseus mindazon mutánsait és variánsait, melyek negamicint termelnek, vagyis azokat, melyeket a Str. purpeofuscus-tól teljesen megkülönböztetni nem lehet és negamicint termelnek. Módszer a negamicin mennyiségének, meghatározására : A meghatározást a szokásos hengeres diffúziós módszerrel, tiszta negamicin alkalmazásával, mint standard anyaggal, végezzük el és az érzékeny organizmus, pl. az E. coli K12, Pseudomonas aeruginaosa stb. lehet. alkalmazható, melyeket a negamicintermelő organizmusok hasznosítani tudnak. A fermentációt addig folytatjuk, míg a negamicin megfelelő mennyiségben nem termelődik, így pl- a Str. purpeofuseus ferde tenyészetéről spórával és micéliummal beoltjuk a táptalajt, mely a következő anyagokat tartalmazza: 2,0% glükóz, 2.0% keményítő, 2,0% szójababliszt, 0,5% élesztő extrakt, 0,25% nátriumklorid, 0,35% kalciumkarbonát, 0,0005% CuS04-5H20, 0,0005% MnCl2 -7H 2 0, 0,005% ZnS0 4 -7H 2 0. A táptalajt beállítjuk pH 7,0-re és rázva, 27 C°-on tenyésztjük. A negamicin termelését ,3— 8 napon át megfigyelve, pl. a harmadik napon 20 /íg/ml, a hatodik napon (pH 7,4) 108 ^g/ml, a hetedik napon (pH 7,6) 185 ^g/ml, a nyolcadik napon (pH 7,8) 122 /tg/ml antibiotikum fejlődik. A negamicin vizes oldatában viszonylag stabil. Így pl. 5 mg/ml negamicint tartalmazó oldatot 60 C°-on 30 peréig melegítve különböző pH-n (mely 1,8; 7,2; 9,:2) 91%-a bomlás nélkül megmarad. Ha 2 mg/l negamicint tartalmazó oldatot egy hétig, 27 C°-on, különböző pH-n tartunk, akkor a negamicin a •következő százalékban bomlás nélkül megmarad: 2,25 pH-n 86%; 4,90 pH-n 80%; 7,15 pH-m 76%; 9,0 pH-n 89%; 10,2 pH-n 79%. A találmány oltalmi köre kiterjed továbbá a negamicin extr akciójára és tisztítási eljárására. A negamicin vízben oldódik és így a fermentlében oldott anyag szerves oldószerbe, mint butanolba, etilacetátba, éterbe, kloroformba, benzolba nem oldható át. A negamicint a fermentléből vagy vizes oldatából adszorbenssel lehet elkülöníteni. Aktív szén az egyik előnyösen alkalmazható abszorbens. Az aktív szénen adszorbeált negamicint hatásosan eluálhatjük vizes metanollal, vizes butanollal, vizes acetonnal. Az anyag könnyebben eluálható, ha az eluáló oldatot sósavval megsavanyítjuk. A negamicin, bár karboxil-esöportot tartalmaz, két bázikus csoportja miatt bázikus tulajdonságú, így kationcserélő gyantán adszorbeálható. A negamicin fermentléből vagy vizes oldatából való extrakciójára a kationcserélővel végzett eljárás a legelőnyösebb módszer. Minden karbonsav-csoportot vagy szulfonsav-csoportot tartalmazó gyanta felhasználható, melyet hidrogén-formában, nátrium-formában, kálium-formában, ammónium-formában vagy kevert formában alkalmazhatunk. A fcationoserélő gyantán adszorbeált negamicin savval, pl. sósavval, kénsawal, stb. eluálható, bár sókkal előnyösebb a vizes ammónia alkalmazása. A negamicin, mely karbonsav-csoportat is tartalmaz, anioncserélő gyantán" is adszorbeálható. Így' például, ä Do -wex 1X2 (Dow Chemical Co., USA, márkaneve) OH-formában adszorbeálja a negamicint és. az adszorbeált negamicin hígított sósavai eluálható. Bár az anioncserélő gyanta gyengén bázikus csoportot tartalmaz, mint amilyen az Amberlite IR45, (Rhom and Haas Co., USA, márkaneve) OH-formában a savas negamicin oldat A Str. purpeofuseus negamicint termel, ha a 35 tenyésztés negamicin termelésére alkalmas körülmények között történik. A negamicint tartalmazó fermentlevet az erre alkalmas táptalaj negamicint termelő organizmus spórájával vagy micéliumával való beoltásával készítjük, aerob 40 tenyésztési körülményék között. Negamicin termelése szilárd táptalajon végzett tenyésztéssel is lehetséges, de nagyobb mennyiség előállítását előnyösebb folyékony közegben végezni. A fermentáció hőmérsékletére az a tartomány a meg- 45 felelő, melyen a negamicint termelő organizmus fejlődik és negamicint termel, melyre a 25— 32 C° hőmérséklettartomány az előnyös. A tenyészoldat az aktinomicetáknak azokat a tápanyagait tartalmazza, melyek alkalmasak nega- 50 micin termelésére. Nitrogénforrásként alkalmazhatók pl. kereskedelmi termékek, mint a pepton, hús extrakt, N—Z amin, kazein, szójababliszt, kukoricalekvár, földimogyoró-liszt, gyapotmagliszt, nátriumnitrát, ammóniumnitrát, ammó- 55 niumszulfát és más nitrogéntartalmú anyagok, mint búzaikorpa, rizskorpa stb. Szénforrásként alkalmazható kereskedelmi termék, pl. glükóz, — glicerin, keményítő, maltóz, dextrin, szacharóz, laktóz és más szénhidrát, továbbá szójababolaj 60 vagy más zsiradék, tiszta vagy nyers állapotban. A tápoldathoz nátriumklorid, nátrium- vagy káliumfoszfát, kalciumkarbonát, és amennyiben szükséges, nyomokban fémsók is adagolhatok. A negamicin termelésére tehát minden olyan anyag g5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3
