160710. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a nyálka viszkozítását az élő szervezetben a fiziológiailag legkedvezőbb értékre beállító enzimkészítmény előállítására

9 szerrel kiküszöbölhetők azolk a bosszú és költséges állatkísérletek sorozatán alapuló vizsgálatok, melyek eredményei nem voltak alkalmasak arra hogy ezeket a gyakorlatba is bevezessék. A találmányunkban ismertetett enzim-vizsga- S lati módszer, az RMV-próba, nem sokban különbözik attól az általunk más helyen már leírt eljárástól, amely azon alapszik, hogy az enzimkészítményt két különböző koncentrációban önmagával hasonlítjuk össze. Az a termék bizo- 10 nyúl megfelelőnek, melynek a nyálka viszkozitására gyakorolt hatása nem változik lényegesen a koncentráció változtatásával. Ha az enzimkészítmény egy megadott koncentrációban a viszkozitásnak 20%-os csökkenését okozza 15 60 perc alatt, az enzimkoncentrációt ötszörakkorára emelve a csökkentés nem lehet nagyobb, mint 40—60%. A leírt módszer hátránya az, hogy előzetes meghatározást tesz szükségessé, esetleg csak egymást követő közelítő 20 meghatározásokkal lehet a 20%-os csökkentést beállítani, és így a meghatározás relatív pontossága nem kielégítő. A találmányunk szerinti módszer, mely abban 25 áll, hogy az enzimkészítményt in vitro közvetlenül összehasonlítjuk tiszta tripszin és kimotripszin enzimatikus hatásával, biztosabb és egymással egyezőbb eredményeket ad. A találmányunk szerinti enzinitkészítmény előállítására a 30 párisi Természettudományi Múzeumban letétbe helyezett két Streptomyees fradiae törzsét használtuk fel (az 1998. és a 2019-es sorszámúakat). Az egyik törzset a klasszikus fermentálási eljárással tenyésztettük ipari körülmények között 35 a következő öisszetételő fermentáló-oldatban: szójaliszt 30 g/liter, glükóz 30 g/liter, dinátriumfoszfát 0,8 g/liter, kaleiumkarbonát 10 g/liter; az oldat pH-ja 7,0. A fermentálási hőmérséklet pontosan 28 °C volt és a percenként átáramol- 40 tátott levegő az oldat térfogatának 0,3-szerese volt. Ilyen körülmények között a Streptomyees fradiae nem termel antibiotikumokat, csak en- 45 zimeket, legalább 5 proteázt és 2 peptidázt. A különböző enzimek szétválasztása hosszú analitikai munkát igényel, amely a gyakorlatban nem vihető keresztül. El kell kerülni, amennyire lehetséges a peptidáz enzim keletkezését, amely 50 nagyobb koncentrációban nem kívánatos, A lényeges az, hogy a kapott enzimkeverék megfelel-e az RMV-próbának, és hogy ez az ellenőrzési mód gyorsan végrehajtható és alkalmas ipari rutinvizsgálatokra. 5S Általában az a tapasztalat, hogy az enzimkeverék a fermentálás korai időszakában nem elégíti ki a RMV-próbát, mert hatása alacsony; kielégítő RMV-próbát ad a fermentálás középső 60 szakaszában, és nem megfelelő az RMV-próba túl erős hatás miatt a fermentálás végső szakaszaiban. Az ismertetett meghatározási módszer tehát alkalmas arra, hogy a fermentálást abban az időpontban állítsuk le, amikor az 65 10 abból kinyerhető enzimkeverék hatása a nyálkára már nagyobb, mint a kimotripszin hatása, de még nem éri el a tripszin hatását. Az ehhez szükséges fermentálási idő nem határozható meg előre pontosan, mert a fermentálásnak sok, nehezen ellenőrizhető körülménye befolyásolja. A szükséges fermentálási idő általában 60 és 84 óra között van, a megfelelő fermentlé enzimtartalma ilyen esetben 3000 Anson-egység milliliterenként. Ä fermentléből a szokásos extrahálási módszerekkel a következő termékeket állítjuk elő (a termékeket RMV-próbával rendszeresen vizsgálva) : A) termék: szűrt fermentlé vákuumban bepárolva, a folyékony maradék nyers enzimkészítmény, mely ml-enként 50 000 A. E.-t tartalmaz. B) termék: a „A" termék porlasztással megszárítva, nyers enzimkészítmény, szilárd por, grammonként 100 000 A. E. tartalom. C) termék: a folyékony „A" termék ammóniumszulfátös kisózásával készül, vákuumban bepárolva, részlegesen tisztított enzimkészítmény, mg-onként 1000 A. E.-t tartalmaz. D) termék: a folyékony „A" termékből készített tisztított anyag, tisztítása kicsapások és viszszaoldások sorozatával történt ammóniumszulfáttal, majd oldószerekkel, elsősorban acetonnal. Az utolsó kicsapásnál kapott anyagot vákuumban megszárítva egy közepesen tiszta enzimkészítményt kapunk, mely mg-onként 10 000 A. E.-t tartalmaz és enzimhatás szempontjából elektroforetíkusan viszonylag monodiszperz. E) termék: a „D"termekből kiindulva folyadékfázisban tisztítjuk élektroforézissel vagy oszlopkromatográf iával, majd dialízissel és liofilizálással szárítjuk. A kapott anyag nagy része egy tisztított enzim, mely mg-onként 50 000 Ansonegységet tartalmaz és elektroforetíkusan vizsgálva teljesen monodiszperz. Mindegyik termék RMV-próba szempontjából megfelelő. A találmány szerint használhatóságuk előfeltétele még az, hogy teljesen érzéketlen legyen a tripszingátlókkal szemben. A későbbiekben (1. példa) látjuk, hogy e termékeik előfeltételnek is megfelelnek, és így alkalmasak a találmányunk szerinti felhasználásra. Egyébként más mikroorganizmusok segítségével is előállíthatunk találmányunk szerint felhasználható készítményeket, az anyagokat tisztítás közben rendszeresen RMV-próbával ellenőrizve, így megfelelő terméket kapunk más Streptomyees törzsekből (pl. S. fradiae) vagy más mikroorganizmusokkal, pl. bacillusokkal is. Az előzőekben leírt A. B. vagy C. készítmények felhasználhatók állat-tápszer keverékek készítésére, pl. az alábbi összetételben: Patkánykísérletek §