160678. lajstromszámú szabadalom • Eljárás A16884 jelzésű antibiotikum előállítására
160678 8 jód és danzilklorid reagensekkel pozitív reakciót ad, negatív az eredmény viszont Fehling, vas-III-klorid, biuret és Sakaguchi reagensekkel. Az eljárás során' A16884 antibiotikumot termelő Streptomyoes lipmanii NRRL 3584 törzset növesztünk asszimilálható szén-, nitrogénforrást és szervetlen sókat tartalmazó táptalajon, süllyesztett aerob körülmények között, míg jelentős mennyiségű A16884 nem keletkezik az említett fermentlében. Az A16884 amfoter molekulájú, kéntartalmú peptid antibiotikum. Mint sok más, antibiotikumot termelő tenyészet esetében, az A16884-termelő lipmanii törzs fermentációja is számos antibiotikus hatású anyag képződéséhez vezet. Az A16884 ezen anyagok egyike. A többi anyag vagy viszonylag instabil, vagy csak igen kis mennyiségben van jelen. Az A16884 antibiotikumot mint ilyet, vagy sójaként, pl. savaddiciós sójaként, vagy egy kationnal alkotott sójaként alkalmazhatjuk. A kationnal alkotott só mono- vagy di-só lehet. Gyakran előnyös, hogy a sókat közvetlenül a tisztítási lépésben képezzük, úgy hogy az antibiotikumot só alakban választjuk el. Az A16884 antibiotikumot így választjuk el, és ezért az alábbiakban monoammóniumsóként jellemezzük. Az A16884 antibiotikum mónoammóniumsója fehér, amorf szilárd anyag, amely 180 °C körül bomlik, vízben igen jól oldódik, oldható dimetilszulfoxidban (DMSO), rövidszénláncú alifás alkoholokban gyengén, acetonitrilben és más szerves oldószerekben pedig egyáltalán nem oldódik. Az A16884 monoammóniumsó fentiekben megadott fajlagos optikai forgatóképességi értéke a szobahőmérsékleten vákuumban vízmentes kalciumklorid felett 15 óráig szárított sóra vonatkozik. Az A16884 antibiotikum monoammóniumsójának 66%-os dimetilformamid-víz elegyes oldatban, 6,6 kezdeti pH-értéken végzett elektrometrikus titrálása négy titrálható csoport jelenlétét igazolta: pK'at = 3,5; pK'a2 = 5,2, pK'a3 = 9,2 és pK'a4 = 10,3. Egy másik mintát ugyanígy, de 5,8 kezdeti pH-értéken titrálva, a megfelelő pK'-értékek: pK'ai = 3,9, pK'a2 = = 5.3, pK'a3 = 9,2 és pK'a 4 = 10,5. Ha az A16884 antibiotikum monoammóniumsóját a savvá alakítjuk át, a 9,2 pK'a4-érték eltűnik. A monoammóniumsó molekulasúlya a titrálási adatokból számítva kb. 435. A vákuumban kb. 80 °C-on, foszforpentoxid felett szárított A16884 antibiotikummonoammóniumsó elemanalízise a következő eredményeket adta: elem % szén 44,01 hidrogén 5,73 nitrogén 10,65 oxigén 31,27 kén 6,86 20 25 30 Az analízis 6,64% metoxitartalmat és 9,23%os acetiltartalmat mutat, a Van Slyke-aminomtrögénmeghatározás 5,Ö9%-os eredményt ad. Az A16884 antibiotikum monoammóniumsójá-5 nak ásványolajban felvett infra spektruma a mellékelt 1. ábrán látható. A spektrum jellemző vonalai 2,0 és 15,0 mikron közötti tartományban ugyanazok, melyeket a fentiekben leírtunk. Az Ä16884 antibiotikum monoammóniumsójá-IQ nak vízben felvett UV-abszorpciós spektruma 242 m/í-nál (Eic ° m =126) és 625 mßnál (Eicm =158) ad maximumot; a cirkuláris dikroizmust szintén vizes oldatban mértük, és az 263 m/i-nál pozitív és 236 m^-nál negatív 15 Cotton-effektust mutatott. Az A16884 antibiotikum monoammóniumsóját papírkromatográfiásan futtatva propanol-acetonitril-víz (1:1:1) rendszerben, 0,79 Rf-érték adódik. Bioautográfiát végeztünk, a papírkromatogramot érzékeny organizmussal, pl. Salmonella gallinarummal tesztorganizmussal fertőzött agarlemezekre helyezve. A DoO-ban felvett NMR-spektrum a következő jellemző adatokat szolgáltatja: 5,16 ppm (1H, szinglet); 4,86, 4,68 ppm (2H, AB kvartét, J = 12,5 Hz); 3,9—3,7 ppm (1H, multiplet); 3,67, 3,29 ppm (2H, AB kvartét, J=18 Hz); 3,53 ppm (3H, szinglet); 2,6—2,3 (2H, multiplet); 2,10 ppm (3H, szinglet); 2,1—1,6 ppm (4H, multiplet). A monoammóniumsót különböző más rend-35 szerekben is futtattuk, papírkromatográfiásan és a következő eredményeket kaptuk: 40 45 50 55 60 65 Oldószerrendszer Rf-érték Etanol-víz (80: 20) + 1,5% nátriumklorid, a papír 1 N nátriumszulfáttal impregnálva 0,58 Metanol-propanol-víz (6:2:1), 0,75 M káliumfoszfáttal (pH 4,0) pufferolt papír 0,21 propanol-piridin-ecetsav-aoetonitril-víz (45 : 30 : 9 : 40 : 36) 0,40 t-amilalkohol-aceton-víz (2:1:2:) 0,40 etilaeetát-ecetsav-víz (3:1:1) 0,36 metiletilketon-víz (92 : 8), a papír 0,1 N nátriumacetáttal (pH 4,6) pufferolva startpontön propanol-víz (70 : 30) 0,30 vízzel telített butanol startponton vízzel telített butanol+2% toluolszulfonsav 0,60 Ha az A16884 monoammóniumsóját szilikagél vékonyrétegen futtatjuk, 70%-os vizes acetonitrilben, hívószerként ninhidrin spray-t használva, az Rf-érték 0,47; cellulózlemezen 70%-os vizes acetonitrilben, a fenti hívót alkalmazva, az Rf-érték 0,45. .2
