160408. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 66-40 antibiotikum előállítására

160408 11 A fermentáció befejeztével a fermentlé például a körvetkezőképpen dolgozható fel: Az egész fermentlé pH-ját ásványi savval, előnyösen vizes kénsarwal kb. 2 értékre állítjuk be, amikoris a vízben oldható bázisos antibiotikum felszabadul a micéliurnból, és oldódik a vizes fermentációs közegben. Az egész keveréket megszűrjük és a szűredéket közömbösítjük, majd oxálsavat adunk hozzá a kalciumionok kicsapására. Ujabb szűrés és semlegesre való beállítás után (előnyösen ammóniával) a víztiszta közömbösített szűredéket ionkicserélő gyantán, előnyösen IRC—90 Amberlite típusú ammónium-fázisú gyantán bocsátjuk át. A kimerült fermentlevet kiontjuk, és az antibiotikumot a gyantáról vizes ammóniáival eluáljuk. Az eluátumot bepárolva nyers 66—40 antibiotikumot tartalmazó maradványt kapunk, amelynek a titere 500 Mg/mg az alább leírt próba eredménye szerint. A nyers antibiotikum ainionkioserélő gyanta alkalmazásával, például Dowex 1X2 vagy Amberlite IRA 451S típusú gyantáival, tisztítható meg. A nyers antibiotikumot vizes oldatából adszorbeáltaitihatjuk az oszlopra, és onnan desztillált vízzel eluálihatjuk. Az így kapott anyag titere kb. 900 /*g/mg. A nyers antibiotikum cellulózzal végzett oszlopkromatografálással is megtisztítható 2:1:1 arányú kloroform-metanoW7%-os ammóniumhidroxid oMószerrendszert alkalmazva; az oldórendszer felső fázisát használjuk először az oszlop átnedivesítésére és az első fázist eluálás céljára. Az antibiotikum az oszlopra az említett oldószerrendszer felső fázisával alkotott tömény oldatból való adszorbeáltatásával vihető fel. A különféle készítmények f-tg/mg antibiotikum tartalom alyakjáiban meghatározott titerét a szokványos gyűrűs-lemezes módszerrel állapítjuk rendszerint meg Staphylococcus aureus ATCC 6688P mikroorganizmust alkalmazva. Ez a módszer analóg az Oden és munkatársai „Antimicrobial Agents and Chemotherapy" (1903) című művében leírttal. Egy pg az antibiotikumnak az az anyagmennyisége, amely 16,3 ±0.9 anm-es hatásterületű a próba körülményei között; az antibiotikus aktivitást /^g/rag egységekben fejezzük ki. A következő példák szemléltetik a 66—40 antibiotikum előállítására irányuló fermentációs és elkülönítési eljárásokat. 1. példa: Micromonospora inyoensis tenyésztése fermentorban 10 15 20 2b 30 35 40 45 50 55 1. Szaporítási művelet: Aszeptikus körülmények között liofilizált M. 60 inyoensis tenyészetet (vagy ferde tenyészetből kapott sejteket) adunk egy 300 ml-es rázott lombikban 100 ml következő összetételű steril táptalajhoz: 65 12 marihahúskivonat tripton élesztőkivonat glukóz keményítő kalciurnkarbonát csapvízzel kiegészítve 3 g 5 g 5 g 1 g 24 g 2 g 1000 ml-re. A lombikot 5 napig 35 °C-on inkubáljuk percenként 280 fordulatú, 50,8 mm löketű forgó rázógépen. 2. szaporítási művelet: Az 1. szaporítási műveletből származó 2/5 ml fennentlevet aszeptikusán átviszünk egy 2 literes rázott lombikba, amely 500 ml fent említett steril táptalajt tartalmaz. A lombikot 3 napig 28 °C-on inkubáljuk egy percenként 280 fordulatú, 50$ mm löketű forgó rázógépen. Fermentációs művelet: A 2. szaporítási műveletbő származó 500 ml fermemtlevet aszeptikusán átviszünk egy 14 literes fermentációs tartályba, amely 9,'5 liter következő összetételű steril táptalajt tartalmaz: dextrin 50 g glukóz 5 g szójababliszt 35 g kalciuimkarbonát 7« kobaltklorid lO-6

mól csapvízzel kiegészítve ÍOOO ml-re habzásgátló (GE 60 = = szilikon emulzió) 10 ml A táptalajt sterilizálás előtt beállítjuk 8 pH-ra. 66—'90 óra hosszat aerób körülmények között fermentálunk percenként 250 fordulattal keverve, percenként 4,5 liter/liter levegőt 22,5 att nyomás alatt bevezetve. Ennek az időszaknak a végén a termelt antibiotikum titere 160— 225 /^g/ml csúcsértéket ér el, és hozzávetőleg állandó marad. A fermentációs közeg pH-ja kissé változik csak az antibiotikum termelés közben 6,8 és 7,3 értékek között. 2. példa: A ©6—40 antibiotikum elkülönítése Az 1. példából származó teljes fermentlé pH-ját 6 n kénaasvval beállítjuk 2 értékre. (Ebben a példában a mennyiségeket az 1. példa szerinti művelettel kapott 17 adag megsavanyított fermentlé egyesítésével kapott 170 liter fermentiere vonatkoztatjuk.) A savas femmentlét kb. 15 percig keverjük, majd megszűrjük. A micéliumot vízzel mossuk, és a mosáfolyadékot egyesítjük a szűredákkel. A szűredék pH-ját 6 n ammóniumhidroxid-oldattal 7 értékre állítjuk be. A közömbösített szűredékhez a kalcium kicsa-6