159995. lajstromszámú szabadalom • Eljárás L-aszparagináz kinyerésére

3 159#95 4 szonylag egyszerűen, de nagyon hatásosan úgy sikerült elérnünk, hogy a kivonathoz a sejílízis után kevés ribonukleázt, dezoxiribonukleázt vagy ezek keverékét adjuk. Azt tapasztaltuk, hogy ha ezekből az enzimekből kis menynyiséget adunk a kivonathoz közvetlenül a lízis után, a szuszpenzió megtörik, és a rendkívül viszkózus kivonat néhány perc alatt átalakul még alacsony hőmérsékleten is viszonylag kis viszkozitású anyaggá. A kivonat kis viszkozitásának köszönhető könnyű szűrhetőségéhez és centrifugáihatósághoz további előnyök járulnak az ezt követő tisztítási műveletekben, például oszlopkromatografálás során, mert az egyébként zavaró nukleinsavakat a ribonukleáz és/ vagy dezoxiribonukleáz hidrolizálja. A hozzáadott ribonukleáz és dezoxiribonukleáz menynyisége 10—0,1 jag/ml, előnyösen 0,25—0,5 /»g/ /ml. Miután a találmány szerinti eljárással sejtmentes kivonatot készítettünk, ebből ismert módon kicsapjuk és eltávolítjuk a nem kívánatos fehérjéket, például mangánkloridos és alumíniumszulfátos kezeléssel. A kicsapódott anyagnak centrifugálással való eltávolítása után a visszamaradt folyadékot frakcionáljuk, például acetonnal, és az enzimet kinyerjük. A találmány haladó volta nem a jobb hozamban rejlik (a hozamot a találmány nem érinti), hanem a szuszpenzió szétválasztásának lényeges megkönnyítésében, a kezelni szükséges térfogat jelentős csökkentésében, a szükséges berendezés ezzel összefüggő méretcsökkenésében és a mindezekkel járó megtakarítási lehetőségekben. A következő példák szemléltetik a találmányt. A hőmérsékleteket Celsius-fokokban adjuk meg. 1. példa: 15 g acetonnal szárított E. coli B (ATCC 9637) sejtet nátriumfoszfát puffer oldatban szuszpendálunk, és lizozimmel kezelünk. 25°-on való 65 perces keverés után dezoxiribonukleázt (IX kristályos) adunk a viszkózus szuszpenzióhoz 0,001 M 8,0 pH foszfátpufferban, úgyhogy a dezoxiribonukleáz végső koncentrációja a viszkózus sejtszuszpenzióban 0,10, illetve 0,25 /xg, /ml. Dezoxiribonukleázt nem tartalmazó kontrollt is megfigyelünk. A dezoxiribonukleáz hozzáadása után 1 perccel a viszkózus sejtszuszpenzió teljesen elfolyósodik, míg a dezoxiribonukleázt nem tartalmazó sejtszuszpenzió viszkózus marad. További 15 percig tartó inkubálás után szobahőmérsékleten a kontroll sejtszuszpenzió éppen olyan viszkózus volt, mint kiinduláskor. Ezután a sejtszuszpenziót 5—i8°~ra hűtjük. Mangánklorid-oldatot adunk hozzá, és a szuszpenziót ultracentrifugában 6000 G-nél centrifugáljuk 20 percig. A sejtroncsok a dezoxiribonukleázt nem tartalmazó szuszpenzióban világosan láthatóan nem szedimentálódnak olyan jól. mint a dezoxiribonukleázzal kezelt sejtszuszpenzióban. Az utóbbiakból kapott folyadék sokkal tisztább, és nyilvánvaló, hogy tökéletesebb elválasztást sikerült elérni. 2. példa: Az 1. példában leírt módon járunk el azzal a különbséggel, hogy dezoxiribonukleázt alkalmazunk 5 és 10 /ig/ml koncentrációban á sejtlízis után 30 perccel. Az elért elválasztás mértéke nem különböztethető meg az 1. példa szerint elérttől. 3. példa: Az 1. példában leírt módon járunk el azzal a különbséggel, hogy amorf dezoxiribonukleázt alkalmazunk 65 perc helyett 20 perccel a sejtlízis után. Az eredmények nem különböztethetők meg az 1. példa szerint elértektől. 4. példa: Az 1. példában leírt módon járunk el azzal a különbséggel, hogy dezoxiribonukleáz helyett azonos mennyiségű ribonukleáz és dezoxiribonukleáz keverékét alkalmazzuk. Az eredmények nem különböztethetők meg az 1. példa szerint elértektől. > 5. példa: 50 g acetonnal szárított E. coli sejtet az 1. példában leírt módon 0,05% lizozimmel kezelünk. Ezután dezoxiribonukleázt adunk hozzá 0,1 /tg/ml koncentrációban, és a keveréket 15 percig keverjük, majd 10°-ra hűtjük. A pH-t nátronlúggal 7,6-ra állítjuk be. Mangánkloridot adunk hozzá, miközben a pH-t 7,5 és 8,0 között tartjuk. A szuszpenziót hidegen centrifugálva derítjük. A derített folyadékhoz ammóniumszulfátot adunk 2 M koncentrációban, és a kicsapódott idegen fehérjéket centrifugálással eltávolítjuk. A derített 2 M ammóniumszulfátos oldathoz hideg acetont adunk, és a kivált I> -aszparaginázt kinyerjük oly módon, hogy a csapadékot vízben szuszpendáljuk. Az L-aszparagináz acetonnal szárított sejtekből való kinyerésének hatásfoka 46%, Specifikus aktivitása 0,58 nemzetközi egységről 2,17 nemzetközi egységre nő fehérje-mg-ként. Az L-aszparagináz akadályozza a rákos szövet növekedését, és kiterjedten alkalmazzák különféle rákos betegségek, többek között nagy sikerrel az emberi leukémia enyhítésére [lásd például: Roberts, Burson és Hill: J. Bacteriology 95. 2117—2123 (1968) és Campbell és mtsai: Biol. Ohem. 6, 721—730 (1967)]. Az L-^aszparagináz nemzetközi egysége (NE) az enzimnek az a mennyisége, amely 37 °C-on 1 perc alatt 1 íimól ammóniát szabadít fel [J, Bact. 95, 2118 (1968)]. Szabadalmi igénypontok: 1. Eljárás L-aszparagináz enzimnek sejtmentes vizes oldat vagy szilárd termék alakjában való előállítására Escherichia coli B L-aszpara-10 15 20 25 S0 35 40 45 50 55 60 2