159815. lajstromszámú szabadalom • Eljárás L-aszparagináz előállítására

159815 A vizsgálati táptalajok előállítására a következőket adtuk hozzá a fenti táptalajhoz: a) 0,25% glukózhidrát, b) 0,26% glukózhidrát és 0,26% glicerin és c) 0,15, 0,26, 0,50 vagy 1,00% glicerin. Ezeket a táptalajokat 30 percig li20 C°-on 1 att nyomás alatt sterilizáltuk. B) A fermentálás Egy kémcsőben levő agartáp talajon teayész-_ tett E. coli B (ATCIC 9637) olaóanyagot 10 ml tett E. coli B (ATOC 9637) oltóanyagot 10 ml steril 0,01%-os nátriumlauirilszulfát oldatban szuiszpendáltunk. A sejtszuszpenziióval (beoltottunk egy lombikban levő 50 ml térfogatú következő összetételű sterilizált táptalajt: 3,0% hasnyálmiriggyel feltárt kazein, 0,7%, hasnyálmiriggyel feltárt szójabafoliszt, 0,25% glukózhidrát, 0,5% nátriumklorid, 0,25% dikáliumhidrogénfoszfát, csapvízzel 100%~ra kiegészítve. Ezt a keveréket 33 C°-on 5 cm löketű és percenként 240 fordulatszámú forgó rázógépen 18 óra hoszszat inkiubáltuk. Egyenként 0,26 ml 18 órás oltóanyaggal beoltottunk négy, 260 ml-es Erlenmeyer-lombiM>an 50—50 ml steril vizsgalati táptalajt. Ezt a négy lomibikot az említett forgó rázógépen 37 C°-on 20 óra hosszat rázattuk, majd a keletkezett sejtszuszpenziót 0—5 C°-on kicentrifugáltuk, és a folyadékfázisit kiöntöttük. A kapott sejtpépet 11 ml 0,02 M 8,0 pH-s foszfátpuffer oldatban szu&zpendáltuk, és 5 percig —il5 5 C°-on ultrahanggal roncsoltuk egy 110 wattos, 20 kcyfeec haa^mdlámo&at keltő Branson {Model S—110) ultrahanggerjesztoben. A roncsolt sejfcszusapettiziót ezután 0,5 G°-on centrifugálva derítettük, a sejtpépet elvetettük, és a folyadékfázist 5,0 pH-^nál in vivo megvizsgáltuk aktw Lsaszparagináz tartalomra Campbell és munkatáreai fent idézett módszere szerint. •A fermentáció során ajánlatos lehet a keverékhez hafotáknátószerefcet, például polipropilénglikolt, lardolajat stb. hoíaáadni. Ezek a szerek részletekben adhatók hozzá a habzás meggátlásához szükséges mennyiségben. A különiélé vizsgálati táptalajokon glukózhidráttal és anélkül és küBníele glicerintartalomanal végrehajtott fermentációk eredményét az 1. táblázatban közöljük. 2. példa: Egy párhuzamos kísérletben az 1. példában leírt műveleteket végeztük el, azzal a különbséggel, , hogy glicerint más arányiban használtunk. Az eredményeket a 2. táblázatban közöljük. 15 20 25 30 35 40 45 50 2. táblázat Glicerin % Glukózhidrát % Tartalom NE/ml Hozamváltozás % 0 0,25 1,01 kontroll 0% 0 0 0,73 -^28 0,01 0 1,45 +42 0,05 0 1,40 +40 0,10 0 1,40 •+44 0115 0 1,45 +42 0,25 0 1,21 +20 1,0 0 0,83 —14,7 A- táblázatból kitűnik, hogy kevés glicerin használata glukózhidrát helyett a reakcióközegben jelentősen megnöveli a fermentáció során termelt L-aszparagináz mennyiségét. Az 1. táblázatból az is kitűnik, hogy a glukózhidrát mellett kevés glicerin használata nem jár előnynyel, a 2. táblázatból pedig az tűnik ki, hogy sem gliukózhidrátot, sem glicerint nem használva jelentősen csökken az L-aszparagináz hozama. Az L-aszparagináz nemzetközi egysége (NE) az az enzknmeninyiség, amely L-aszpar:aginból 37 C°-on 1 perc alatt 1 /xmől ammóniát szabadít fel. [3. Roberts és munkatársai: J. Bacteriology, 95, 211« (1968)]. Az L-aszparagináz rákellenes hatású, és alkalmasnak bizonyult a fehérvérűség tüneteinek megszüntetésére. [J. Roberts és munkatársai: J. Bacteriology, 95, 2117—2123 (1968)]. Szabadalmi igénypontok: 1. táblázat Glukóz-HozamGlicerin hidrát Tartalom változás % % NE/ml % 0 0,25 0,90 kontroll 0% 0,15 0 1,62 +•78 0,25 0 1,51 +•67 0,50 0 1,21 +•33 1,0 0 0,8« —5,3 0,25 0,25 0,90 0 55 60 65 1. Eljárás L-aszparagkiáz előállítására Escherichia coK baktéritumfaj vizies táptalajon való fermentációjával a tenyésztést hasnyálmirigygyei feltárt kazeint, hasnyálmiriggyel feltart szójafoablisztet, nátriumkloridot és dikálrumhidrogénifoszfátot tartalmazó táptalajon végezve, azzal jellemezve, hogy a táptalajt O/Jl—0,75 s% glicerin hozzáadásával készítjük el. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja azzal jellemezve, hogy a tenyésztést 3,0 s% hasnyálmineggyel feltart kazeint, 2