159630. lajstromszámú szabadalom • Eljárás bizonyos allergének ellen hatásos reaginimmunoglobulinek kvalitatív és/vagy kvantitatív meghatározására vizes mintákban és az eljárás kivitelezésére alkalmas reagens-kombináció
159630 13 ' . • 14 Scand. 18, 2193. oldal, 1934.). 100 mg fenti részecskéket tartalmazó szuszpenziőhoz vizes nátriumíhidrogénkarbonát-oldatban kereskedelmi forgalomban levő 1 ml allergén-kivonatot adunk, amelynek koncentrációja az 1. példa szerinti allergén-oldát koncentrációjával közel megegyezik. A keveréket szobahőmérsékleten hároim napon keresztül inkubáljuk, eközben függőleges helyzetiben állandó lassú . forgásban tartjuk. A részecskéket ezután centrifugában 0,5 mólos nátriumhidrogénkarbonát-oldattal, 0,1 mólos acetát puflférrel, végül 1% szarvasmarha szérumalbumint tartalmazó" 0,1 mólos trisz-puMerrel kétszer-kétszer mossuk. A mosott részecskéket homogenizáljuk és 1% szarvasmarha szérumalbumint tartalmazó 0,1 mólos trisz-ípufiferben szuszpendáljuk. B. Osztályspecifikus determinánsokat (ún. Fc-frakciót) tartalmazó reagin-Ig frakció izolálása Az l.B. példa szerint élőállított 100 mg reagin-Ig-t 0,1 mólos nátriumfoszfát-pufferben (pH = 7,0) 0,1 mólos ciszteinnel 4 óra hosszat 37 Cc -on 1 mg papainnal inkubálunk. Ezután a reakciót j ódacetamid oldat beadagolásával (végkoncentráció 0,05 mól) megszakítjuk. A reakciókeveréket dextránból és epiklórhidrinből képzett kopolimer felhasználásával (Sephadex G 150) gélszűréssel frakcionáljuk. 1 gramm szilárd anyagra számítva 15 g vizet nyerünk vissza, míg a gélágy eluálását 0,1 mólos trisz-HCl-pufferrel és 7,7 pH-értékű 0,2 mólos nátriumklorid-pufferrel végezzük. Az Fc-frakciót immunizálási célból összegyűjtjük. C. A reagin-Ig Fc-frakciójának megfelelő ellenanyagok előállítása A B. szerint előállított, reagin-Ig Fc-frakciójának megfelelő antiszérum előállítását az l.C. példa szerinti módon végezzük, amelyben a reagin-Ig ellen használható antiszérum előállítása van ismertetve. Az Fc-frakciójának megfelelő ellenanyagokat ebből az antiszérumból izoláljuk, amelyet az l.C. példa szerinti módon a következő eltéréssel adszorpciónak vetünk alá: 2 gramm brómacetilcellulóz és reagin-Ig komplexéből álló anyagot 34 ml oldattal elkeverünk, amely megközelítően 95 mg immunoglobulint tartalmaz. Ez utóbbit ioncserélő kromatográfiás módszerrel az antiszérumból izoláljuk. A kapott szuszpenziót 7 pH-értéken és + 4 C°on 2 óra hosszat aktiváljuk, majd 20,000 g mellett 20 percig +10 C°-on centrifugáljuk. A felülúszó folyadékot eltávolítjuk, a cellulózt 6—7 pH értékű 0,15 mólos NaCl—3 mólos karbamideleggyel mossuk, végül a felső fázist eltávolítjuk. Ezt a mosási műveletet addig ismételjük, míg a felső fázisban fehérje már nem mutatható ki. A cellulóz-fehérje komplexet 9 ml 0,1 mólos glicin-HCl-pufferhez (pH = 3,1) adjuk és a keveréket 4Q percig állandó kavarás közben +37 C°-on inkubáljuk. Az. egész oldatot centrifugáljuk, majd a felülúszó részt 1,200 ml 0,01 mólos trisz—HCl—0,1 mólos NaCl (pH 7,1) pufferrel szemben 48 óra hosszat +4 C°-on dializáljuk. A kapott oldat megközelítően 1 mg ellenanyagot tartalmaz ml-ként, amely a reagin-Ig Fc-frakcióval szemben specifikus, így a teljes reagin-Ig-vel szemben specifikusnak tekinthető. Az így előállított ellenanyag kb. 10 millió meghatározáshoz elegendő. , D. A reagin-Ig Fc-frakciójának megfelelő specifikus ellenanyagok jelzése. A jelzési műveletet az 1. példa szerinti módon végezzük, ahogy azt a reagin-Ig-re ismertettük. E. Meghatározási módszer 1. 0,5 ml A. szerint előállított, kémiailag kötött allergéneket tartalmazó részecske-szuszpenziót két kémcsőbe bemérünk; a szuszpenzió ml-ként 1 mg részecskét tartalmaz. 2. 0,05 ml pacienstől származó szérumot az egyik kémcsőbe mérünk. 3. 0,05 ml nem allergiás pacienstől származó kontroll szérumot a másik kémcsőbe mérünk. 4. A kémcsövek tartalmát 5 óra hosszat szobahőmérsékleten inkubáljuk, eközben a kémcsöveket függőleges síkban lassú forgásban tartjuk. 5. A részecskéket 1 percig 3000 fordulatszámmal centrifugáljuk, majd a felülúszó folyadékot eltávolítjuk. 6. A részecskéket háromszor 1% szarvasmarha szérumalbumint tartalmazó, 7,4 pH-értékű 0,1 mólos trisz-pufferral mossuk. A felső fázist minden egyes centrifugálási művelet után leszívatással eltávolítjuk. A leszívatási műveletnél arra ügyelünk, hogy a leszívatott folyadék szilárd részecskéktől mentes legyen. 7. 0,1 ml C. szerint előállított, a reagin-Ig Fcfrakciójának megfelelő Jí25 izotóppal jelzett ellenanyagot tartalmazó oldatot minden egyes kémcsőbe bemérünk. 8. A részecskéket 1 percig 3000 fordulatszámmal centrifugáljuk, majd a felülúszó folyadékot eltávolítjuk. 9. A kémcsövek tartalmát 15 óra hosszat szobahőmérsékleten inkubáljuk, eközben a kémcsöveket függőleges irányban lassú forgásban tartjuk. 10. A részecskéket háromszor 1% szarvasmarha szérumalbumint tartalmazó 0,1 mólos triszpufferrel (pH 7,4) a centrifugán mossuk és minden egyes mosási művelet után a felső fázist szívatással eltávolítjuk. A leszívatásnál arra ügyelünk, hogy a folyadék szilárd részecskéktől mentes maradjon. 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 m 7
