159630. lajstromszámú szabadalom • Eljárás bizonyos allergének ellen hatásos reaginimmunoglobulinek kvalitatív és/vagy kvantitatív meghatározására vizes mintákban és az eljárás kivitelezésére alkalmas reagens-kombináció
9 tartalmazó 0,1 mólos trisz^pufferben egyenletesen szuszpendáljufc. B. Reagin-Ig előállítása Az IgA, IgD, IgG és IgM immunoglobulinektől mentes reagin-íg-t mielóma betegségben szenvedő paciens vérszéruimálból vesszük, akinél a vérszerumiban magas reagin-Ig tartalom állapítható meg. A vérszérumból a reagin-Ig-t kisózással, gélszűréssel vagy ioncserélő kromatográfiával izoláljuk az alábbi módón. Mielornatózisbian szenvedő paciens megolvasztott vagy frissen levett vérplazmáját 0,15 mólos nátriuimkloridoldattal hígítjuk, így az M-komponensre számítva (reagin-Ig) 15 mg/ml koncentrációt állítunk: be. A koncentrációt géldiffúziós módszerrel határoztuk meg (vö. Mancin! és mtsai, „Immunocbemistry", 2, (1965), 235. oldal). A kiosapást 26 C°-on vízmentes nátriumszulfáttal (18 g/100 ml) végezzük. 1 óra állás után a csapadékot ceritrifugálással elkülönítjük (10.000 g, 20 perc, 25 C°). Az üledéket összegyűjtjük, és nátriumszulfát oldattal (18 g/ /100 ml) mossuk, majd 0,8 térfogait 7,5 pH-értékű 0,1 mólos nátriumfoszifát^putfferben feloldjuk. Az* anyagot a fenti módon mégegyszer kicsapjuk és feloldjuk. Az utolsó lecsapás után az üledéket 20 C°-on 8,0 pH-értékű 04 mólos trisz-HCl pufferiben feloldjuk és 3,2 X 30 cm méretű DEAE-Saplhadex A—50 oszlopra töltjük, amelyet előzetesen az előbbi pufferrel egyensúlyig mosunk. Az anyag eluálását folyamatos gradiens alkalmazásával 8,0 konstans pH-értékű 0,1 mólostól 1 mólosig terjedő trisz-HGl-puififerrel 20 C°-on végezzük. A reagin-Ig-t tartalmazó frakciókat összegyűjtjük és 3,2X95 cm méretű Sephadex G 150 oszlopon töményítjük. Az oszlopot előzetesen 0,1 mólos trisz-HC1-0J2 mólos NaCl-0,00i2 mólos EDTANa^ puflferrel egyensúlyig mossuk; a puffer 7,7 pH-értékű és 0,Q2a/o nátmumazidot is tartalmaz. Az anyagot háromszor átengedjük az oszlopon (recirkulációs kramatografálási technika). A reagin-Ig-t tartalmazó frakciókat összegyűjtjük és 4 C°-on ultraszűréssel (Visking cső 8/32") töményítjük. A reagin-Ig-t tartalmazó frakciókat géldlfifüziiós módszernél (Mancini és mtsai, Immunocihemiatry, 2, (1965), 235. oldal) azonosíthatjuk és határozhatjuk meg 'reagin-Ig-vel szemben, specifikus antiszérumot használva. A fenti módon előállított reagin-Ig-t 0,1 Vonal kevesebb össaes fehérjetartalmú egyéb immunoglobulinek, (IgA, IgD, IgG és IgM) szennyezik. A tisztított, reagin-Jg eléktroforézis során egy maximumot mutat, 8,6 pH-értéken és 8 C°-on. [Barbiturates puffer, ionerőssége (I) = 0,05, vándorlás a ß—y tartományban.] Az ultracentrifugálási kísérletekiben 59780 fordulatszámon, 0,2 mólos NaCl-ban egyetlen határfelületi réteg mutatkozik és az ülepedési konstans S^cu,' számított értéke 8,20 S. A reagin-Ig mólsúlya számítás alapján 200 000 ±5 000, 0,713 om3/g parciális fajlagos térfogat mellett. 10 ha a reagin-<Ig-t alkotó aminosavakat és szénhidrogéneket vesszük alapul. A diffúziós konstans D°'M,W , számítások alapján 3,71 X10-1 cm_2 /see értéknek adódik. Meghatározható 20 5 C°-on 4908 fordulatszámú ultracentrifugában. Redukciós kísérletek során bebizonyosodott, hogy a reagin-Ig két típusú polipeptid láncból áll és így a többi széruim-immunoglobulinhoz hasonlít. Az analízis szerint a reagin-Ig-ben 10 két rövidebb polipeptid lánc mutatható ki. amelynek molekulasúlya 2i2 600. A hosszú polipeptid láncok — beleértve a szénhidrát jellegű mesterséges csoportot vagy csoportokat is — molekulasúlya kib.. 77.400, feltételezve azt, hogy 15 a. hosszú és rövid polipepitidláncok aránya a természetes reagin-Ig-ben 1:1. A reagin-Ig aminosav és szénihidrát összetételét a következő 1. táblázatiban szemléltetjük: 20 1. táblázat A reagin-Ig aminosav és szénhidrát összetétele 25 Aminosavgyök Aminosav gramm/100 gramm fehérje Triptofán 3,67 Lizin 4,20 Hisztidin 2,16 Arnid-N 1,34 Arginin 5,6.3 Aszparaginsav 6,73 Treonin 9,01 Szerin 8,52 Glutaminsav 8,93 Prolin 5,24 Gliein 3,13 Alanin 3,92 Fél-cisztin 2,15 Valin 5,59 Metiondn 1,17 Izoleuein 2,29 Leucin 6,08 Tirozin 4,63 Fenilalanin 3,91 88,29 55 Szénihidrátgyök, Szénhidrát gramm/100 gramm fehérje N-aeetil-glukózamin 4,60 Hexóz j(igalaktóz + mannóz) 5,34 L-fukóz 0,51 N-acetil-neur aminkarbonsav 1,126 65 11,71 5
