159630. lajstromszámú szabadalom • Eljárás bizonyos allergének ellen hatásos reaginimmunoglobulinek kvalitatív és/vagy kvantitatív meghatározására vizes mintákban és az eljárás kivitelezésére alkalmas reagens-kombináció
159630 6 mos szerkezet megfelel erre a célra. A hídkötés egyedüli célja ui. az, hogy az allergénne»k az, oldhatatlan polimerről való leoldodását, lemosását megakadályozza. A találmány szerinti módszer azon a felismerésen alapszik, hogy a reagin-Ig mind a specifikusan leküzdendő allergénhez, mind az általában a reagin-Ig ellen használt ellenanyagokhoz kötődhet. Az ilyen ellenanyagok legalább kétértékűek, vagyis legalább két molekula reagin-Ig-t kötnék meg. A reagin-Ig ellen használt ellenanyagok és a reagin-Ig önmagában is, sugárzást kibocsátó atommal vagy atomcsoportokkal, pl. radioaktív izotópokkal vagy fluoreszcensz-csapoirtokkal jelölhető. Az ismert bőr-teszttel és izgatási-teszttel öszszehasoniítva a találmány szerinti eljárásból az az előny fakad, hogy a specifikus típusú allevgénnel reakcióképes reagin-Jg jelenléte és mennyisége in vitro meghatározható. Ezáltal lehetőség nyílik az allergének specifikus csoportjainak, így az állati vágy növényi eredetű allergénéknek a paciens vérmintájában igen érzékeny és egyszerű módszer segítségével történő meghatározásária, amely a paciens szempontjából veszélytelen és kellemetlen melléktüneteket sem okoz. A találmány szerinti módszerrel kapott eredményeket összehasonlítottuk a bőr- és kiváltó- tesztekkel kapott eredményekkel (The Lancet, 1967. november 25. 1105—1107. oldalak). A bőr-tesztet a találmány szerinti módszerrel (R.A.S.T.) összehasonlítva azt tapasztaltuk, hogy az eredmények az esetek 68%-álban egyeztek, míg a kiváltó-teszttel végzett' összehasonlításkor 96%-os egyezést tapasztaltunk. Ismeretes, hogy a kiváltó-teszttel kapott eredmények sokkal megbízhatóbbak, mint a bőr-teszt eredményei, tehát a találmány szerinti módszer gyakorlatilag . ugyanolyan megbízható eredményeket ad, mint a kiváltó-teszt. A találmány szerinti eljárás lefolytatása szempontjából döntő jelentőségű, hogy a kísérleti allergen — amellyel szemben hatásos reagirir-Ig meghatározásra kerül — igen erősen kötődve legyen a víz-oldhatatlan hordozóanyaghoz. Az allergénnel reakcióba lépett reaj gin-Ig így könnyen éTviála^s^íh^o^^nemíllIif^ ' gén kötődésű immunoglobulinéktől. Az eljárás |" további szakaszai során a-iKferreTRéz nem kö] tődött ellenanyagok és a reagin-Jg igen könynyen elválasztható azoktól az anyagoktól, amelyek a polimerhez kötődtek. A különböző megkötött anyagokat tartalmazó / polimer továbbá könnyen elválasztható a folya,1 dékfázisitól. Az elválasztási művelet fiziológiai < határokon belül érzéketlen a folyadék só- és fehérje-koncentrációjának változásaival szemben, így a teljes meghatározási eljárás, beleértve a szabad, jelzett ellenanyagok és reagin-Ig elválasztása, másrészt a polimeren megkötődött jelzett ellenanyagok és a reagin-Ig elválasztása, ugyaj ^b^iaji_a--kéinjc^ő^eji_ej!yjéj anélkül, hogy lecsapószerek vagy hasonló anyagok adagolása szükséges lenne. A találmány szerinti módszer lehetővé teszi 5 az izolált reagin-Ig és a leküzdésére hatásos ellenanyagok mennyiségének megbecsülését. A reagin-Ig az allergiában szenvedő paciens várszéruniából nyerhető ki, ritkább eseteikben a reagin-Ig-t képző szövetek neoplazmájából izo- , 1U lálíható. A reagin-Ig a fehérjék elválasztására J használt különböző módszerekkel, így gél-szűréssel, ioncserélő-kromatográfiávial vagy elektroforézissel tisztítható. A többi immunoglobulinhoz hasonlóan a reagin-Ig is kémiai vagy 15 enzimatikus úton egy antigént megkötő frakcióra és az osztályra specifikus determinánsok hordozóanyagát képző frakcióira választható szét. A reagin-Ig-nek megfelelő ellenanyagok !s-20 mert módszerekkel készíthetők pl. kísérleti állatok, immunizálására alkalmas módszerek segítségével. Eszerint a kísérleti állatoknak szubkután injekciók alakjában ismétlődően kisebb mennyiségben antigének és megfelelő segéd-25 anyagok, például Freund-tféle ásványolaj-szuszpenzió keverékét adagoljuk. A kísérleti állatokban, pl. nyúlban képzett ellenanyagok az állatok vérszérumából izolálhlatok. Specifikus ellenanyagok, így pl. a reagin-Ig 30 osztály-specifikus determinánsoknak megfelelő ellenanyagok, úgy állíthatók elő, hogy az illető determinánsokat tartalmazó reagin-Ig frakcióval — amely a reagin-Ig-iből leihasítással képezhető — immunizálást végzünk, vagy a spe-35 cifikus ellenanyagokat az ellenanyagok keverékéből izoláljuk, amelyeket az eredeti reagin-Ig-vel történő immunizálátsnál kaptunk. A reagin-Ig-nek megfelelő specifikus ellenanyagok adott esetben az antiszérumból is izo-40 lálíhatók ismert immunoszorbens technikával, pl. a reagin-Ig-t brómacetil-cellulózzal kapcsoljuk, majd a kapcsolt reagin-Ig-hez kötött ellenanyagokát a pH-érték csökkentésével felszabadít juk. 45 Néhány esetben előnyös specifikus ellenanyagok használata a reagin-Ig-ben levő osztályspecifikus determinánsok ellen is abból a célból, hogy a kísérletek során igen nagy biz-50" .tonsággal és pontossággal lehessen dolgozni. A reagin-Ig és a reagin-Ig-nek megfelelő ellenanyagok radioaktív izotópokkal való jelzése a szokásos módon végezhető. Erre a célra megfelelő izotópot, pl. J125 izotópot (Hunter és 55 Greenwood-módszerével készített) választunk. Hasonlóképpen a fluoreszcens csoportokkal történő jelzés is ismert, pl. valamely fluoreszcein-izotiocianáttal reagáltatunk. Allergén-tarMmú kivonatok, így pl. kutya(jo vagy ló-epitéiiumból, rétikomócsiniból vagy nyírííavirágpocból származó kivonatok a kereskedelmi forgalomban beszerezhetők. A radioaktivitás meghatározása is a szokásos metodikával végezhető, pl. erre a célra B5 szcintillációs detektorokat alkalmazunk. Hason-3
