159366. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szubsztituált pregna-4,16-dién-3,20-dionok előállítására
159366 .. 25°-on állandó rázás közben (percenként 280 fordulat 5 cm löket) végzett 24 órai inkubálás után 10 tf% fermentlevet átvittünk négy van 250 ml-es Erlenmeyer-lombikban levő 50—50 ml frissen sterilizált B táptalajba. Ezután hozzáadtuk a szteroidot (200 /ig/ml), minden lombikba 0,25 ml 40 mg/ml koncentrációjú steril N,N-dimetilf ormamidos 21 -acetoxipr egna,-4,16-dién --3,20-dion oldatot öntve. Összesen 400 mg-ot fermentáltunk. ^lk 238 mu (s, 23,150), ÁNujoi2,90, 5,99— max r \ y > /> max ? ' „ „ SiMe, 6,02 ix, 6,i20, 630 /*, TCDC1 4 3 8,68 (e, 18—CH 3 ), 8,72 (e, 19—CH3 ), 5,48 (k,' 21—CH 2 ), 5,28 (k, Wj7 = 12 eps, 15«—H), 4,25 (é, 4—H), 3,27 (d, J —3, 16—H) (d = dupla). Összetétel: C21 H 28 0 4 (344,44): számított: C 73,22, H 8,19% talált: C 72,59, H 8,15%. 4. példa: 15;/?,21-Dihidroxipregna-4,16-dién-3,20-dion-15,21-diacetát 10 Mintegy 44 órai, a fent leírttal azonos körülmények között végzett inkubálás után a lombikok tartalmát egyesítettük, és a fermentlevet Seitz-féle derítőszűrőn átszűrtük. A lombikokat. 15 a mioéliumot és a szűrőt több 100 ml-es adag meleg vízzel mostuk. Az egyesített szűredék és mosófolyadékok térfogata |2000 ml volt. Ezeket 3 ízben 600—600 ml kloroformmal extraháltuk, a kivonatokat egyesítettük, vízzel mostuk, és 20 csökkentett nyomás alatt bepároltuk. A 196 mg maradékot aceton és hexán elegyéből kikristályosítva 51 mg 15!/?,21-dihidroxipregna-4,16-dién-3,20-diont kaptunk 219—221° olvadásponttal: [Ö]25 D =+48,6° (kloroformban). 25 30 35 40 25 mg 15,/?,21-dihidroxipregna-4,16-dién-3,20--dionnak 3 ml száraz piridinnel és 1 ml ecetsavanhidriddel készült oldatát 16 óra hosszat 45 szobahőmérsékleten állni hagytuk, majd jeges vízzel hígítottuk, és kloroformmal extraháltuk. A kloroformos oldatot sorban 2 n sósavval, 5%-os nátriumhidrogénkarbonát-oldattal és vízzel mostuk, és csökkentett nyomás alatt be- 50 pároltuk. A maradékot vékonyrétegen kromatografáltuk HF254 kovasavgélen, 1 : 1 térfogatarányú etilacetát-kloroform elegyet használva kifejlesztő oldószerként. Az ultraibolya fényben látható Rf kb. 0,6 sávot elválasztottuk, és 20% 55 metanolt tartalmazó etilacetáttal eluáltuk. Az oldatot bepárolva nem kristályosodó 15/5,21-dihidroxipregna-4,16-dién-3,20-dion-15,21-diacetátot kaptunk. 60 SiMe, TC DCI 4 3 8,74 (e, 18—CH 3 ), 8,74 (e, 19—CH 3 ) S 7,92 (e, 15—OAc), 7,83 (e, i21—OAc), 4,56 (k. W7Í = kb. 9 cps, 15tt—H), 4^27 (e, 4—H), 3,28 (d, J=2,5, 16-H). 65 5. példa: 15,ß,21 -Dihidroxipregría-4,16-dién-3,20-dion és 14a,21-dihidroxipregna-4,16-dién-3,20-dion-21-acetát Absidia coerulea (CBS, Centraalbureau voor Schimmelcultuur, Baarn, Hollandia) mikroorganizmust tenyésztettünk a következő összetételű ferde agar táptalajon (A): glukóz 10 g élesztőkivonat 2,5 g dikáliumhidrogénfoszfát 1 g agar 20 g . desztillált vízzel kiegészítve 1 literre. Két kéthetes felületi tenyészetet szuszpendáltunk 5 ml 0,01%, nátriumlaurilszultfátot tartalmazó vízben. Ebből a szuszpenzióból 1—1 ml-rel beoltottunk nyolc 250 ml-es Erlenmeyer-lombikban 50—50 ml következő összetételű steril táptalajt (B): kukoricalekvár 6 g ammóniumdihidrogénfoszfát 3 g élesztőkivonat 2,5 g glukóz 10 g kalciumkarbonát 2,5 g desztillált vízzel kiegészítve 1 literre. 25°-on állandó rázás közben (percenként 280 fordulat, 5 cm löket) végzett 24 órai inkubálás után 10 tf% fermentlevet átvittünk harmincnégy db 250 ml-es Erlenmeyer-lombikban levő 50—50 ml frissen sterilizált B táptalajba. Ezután hozzáadtuk a szteroidot (300 i/tg/ml), minden lombikba 0,25 ml 60 mg/ml koncentrációjú steril N,N-dimetilformamidos 21-acetoxipregna-4,16-dién-3,20-dion oldatot öntve. Összesen 510 mg-ot fermentáltunk. Mintegy 30 órai, a fent leírttal azonos körülmények között végzett inkubálás után a lomb: kok tartalmát egyesítettük, és a fermentlevet Seitz-féle derítőszűrőn átszűrtük. A lombikokat, a micéliumot és a szűrőt több 100 ml-es adag meleg vízzel mostuk. Az egyesített szűredék és mosófolyadékok térfogata 1700 ml volt. Ezeket 3 ízben 500—500 ml kloroformmal extraháltuk, a kivonatokat egyesítettük, 2 ízben 700 ml vízzel mostuk, és csökkentett nyomás alatt bepároltuk. A 260 mg maradékot átkristályosítva 97 mg 15^,21-diihidroxipregna-4,16-dién-3,20-diont kaptunk. Az anyalúg-maradékot a 4. példában leírt módon szobahőmérsékleten 16 óra hosszat acetiloztuk. A terméket HF254 kovasavgél vékonyrétegen kromatografálva ultraibolya fényben két látható sávot találtunk. A kevésbé poláris sávból 7,6 mg 15/?,21-dihidraxipregna-4,16-dién-3,;20-dion-15,i 21-diacetátot, a polárisabb sávból 5 mg 14!a,21-dihidroxipregna-4,16-dién-3,20-dion-21-acetátot kaptunk. 4
