159356. lajstromszámú szabadalom • Eljárás B12-vitamin előállítására
159356 4 organizmus-sejteket, a szétroncsolódó sejtekből a B12 -vitamin és a B 12 -faktorok a B 12 -fehérje kötés felhasadásával oldatba mennek.A feltákötés felhasadásával oldatba mennek. A feltárásnak és a feherjeanyagdk eltávolításának a fehérje denaturálását elősegítő vagyi anyagok adagolásával, vagy a pH-ér,ték megváltoztatásaival kombinálják. A fenti elveken alapuló eljárást ismertet pl. a 153 740 sz. magyar szabadalmi leírás, amely szerint az ott ismerteti félszintetiilkus — melaszt, élesztőhidrolizátumot, majlkivonatot, kukoricalekvárt, szervetlen sókat, metanolt, borostyánkősavat, gücint, o-xilidint, valamint napi 1 mg/liter 5,6ndimeitilbenzimidazolt tartalmazó — táptalajon, az ilyen táptalajon adaptált szennyvíziszaperedetű mikroorganizmuspopulációval 6—7000 y/titer B^-vitamintartalmú fermentlé nyerhető, amelyet a fermentáció befejezete után 4—5 pg -értéken, 80—95 C°-on történő 10 perces hőkezeléssel tárnak fel és az így nyert vizes Bi2-o.ldatot dolgozzák fel tovább a kristályos Bi2 -vitamin kinyerésére. Ennek az eljárásnak a továbbfejlesztésére, a fermentáció Bt2-vitatminhozamának növelésére és a kinyerés hatásfokának javítására folytatott kutatómunkánk során elsősorban a beadagolt prékurzor mennyiségének a B^hozamra gyakorolt hatását tanulmányoztuk és megállapítottuk, hogy az 5,6-dirnetilbenzimidazol mennnyiségének további növelése nem eredményezi a termelt Bi2-szint növekedését; megállapításunk szerint ennek az az oka, hogy az 5,6-dimetilbenzimidazol rossz vízoldhatósága következtében legnagyobbrészt akkor is kicsapódik a táptalajból, ha metanolos oldatban adjuk hozzá; az így kicsapódott prekurzort a mikroorganizmusok már nem képesek hasznosítani és így tulajdonképpen a prekurzornak a nagytérfogatú vizes táptalajban való oldhatósági viszonyai szabnak határt a Bn-vitamin bioszintézisének és gátolják az ismert eljárással ölért 6—7000 y/liter B12 -szint további növelését. E felismerésünk alapján elsősorban oly eljárás kidolgozását tűztük ki célul, amellyel a fermentációs táptalajhoz adott 5,'6-dimetilbenzimidazolnak nagyobb mennyiségét lehetne a mikroorganizmusok számára hozzáférhetővé tenni. Ennek során még azt is megállapítottuk, hogy a prékurzor metanolos oldat alakjában történő adagolása nemcsak azzal jár, hogy a táptalajban erősen felhíguló alkoholos oldatból az 5,6-ibenzimidazol túlnyomó része kicsapódik és így a bioszintézis számára elvész, hanem a metanolos oldatban adagolt prekurzoroknak a mikroorganizmusok általi felhasználását nehezíti az a körülmény is, hogy az 5,6-dimetilbenizimidazol és a metanol között nehezen disszociáló hidrogénhídszerű kapcsolat alakul ki. E hátrányok kiküszöbölése érdekében igyekeztünk az 5,6KÍimetilbenziimidazolt metanolos oldat helyett valamilyen vízben jobban oldódó alakban hozni és így a táptalajhoz adagolni; a kézenfekvőnek látszó kémiai módszerek, pl. vízben oldódó addiciósvagy kvaiternersók képzése azonban nem bizonyultak célravezetőknek: az 5,6--dimetilbenzimidazol különféle anionokkal képe-5 zett sói (szulfát nitrát, stb.) vízben jól oldódnak ugyan, -a sejt anyagcseréiolyamataibani nem kapcsolódnak be és így a B^-vitammhozam növeléséhez nem járulnak hozzá. A B^-vitamintermelés alacsonyabb éritéke, valamint a sejtmentes fer-10 mentlében papírkromatográfiás módszerrel viszszaimért fel nem használt szabad prékurzor, a B12 -vita:min mennyiségéből számított beépült prékurzor összege mutatja, hogy a külön-külön történt betáplálásnál a komplex nem jön létre, 15 valószínűleg a nagy hígítás (a betáplált kukoricalekvár ötezerszeresen, az 5,6-dimetilbenzimidazol 500 000-szeresen hígul) miatt. Meglepő módon azt találtuk, hogy kukoricalekvár kb. kétszeres mennyiségű vízzel készí-20 tett oldatában a szilárd kristályos 5,6-dimetilbenzimidazol 40—60 C°-on történő huzamos (10—20 perces) melegítéssel teljesen feloldható és ily módon — feltehetőleg a kukoricalekvár vízben oldható peptidjéivel vízben oldódó 25 komplexet képezve — olyan vizes oldatot ad, amelyből a táptalajon való felhíguláskor sem csapódik ki az 5,6-dirnetilbenzimidazol és amelyből a mikroorganizmusok maradék nélkül hasznosítani tudják a bioszintézis folyamatához 30 a prekurzort. Ily módon az eddig lehetségesnél jóval nagyobb mennyiségű prekurzort tudunk oldott és a mikroorganizmusok által jól hasznosítható alakban a tápközegbe vinni. Ez az eddiginél nagyobb prekurzor-koncentráció igen 35 jelentős mértékben befolyásolja a kívánt irányban a bioszintézis menetét: a B12 -vitamintermelés lényegesen megnövekszik és az eddigi maximális 6—7000 y/liter helyett 10—11000 y/liter szintet ér el, ugyanakkor számottevően 40 ^megnövekszik a fehérjeszintézis is, ami a fermentlében keletkező elkülöníthető biomassza tömegének 20—30'%-os megnövekedésében nyilvánul meg. A kukoricalekvár összetételének ismert volta lehetőséget adott arra is, hogy az egyes elkülönített frakciókat és komponenseket külön vizsgáljuk annak megállapítására, hogy a kukoricalekvár melyik komponense játszik lényeges szerepet az 5,6-dimetilbenzimidazol oldatba vitelében. A kukoricalekvár egyes komponenseit (nátrium- és káliumlaktát, Bi- és B2-vitamin, nikotinsavamid, p-aminobenzoésav, piridoxál, m-inozit, kolin, betain, fólsav, lizin, aszparaginsav, treonin, szerin, glutaminsav, alanin, leucin) olyan fermentációhoz adtuk, amelynek táptalajából a kukoricalekvárt elhagytuk. Az adagolt komponensek mennyisége 0,5 és 2,0 g/10 1 fermentlé között változott. A Bi2-vitamin termelési értékeket figyeltük egy olyan fermentációval szemben, amely kukoricalekvárt tartalmazó táptalajon ment végbe, Az egyes komponenseket tartalmazó fermen-65 tációban a Bi2 -tartalom 4000—4500 y/l-t, a ku?
