159304. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nagytisztaságú tripszininhibitor és kallikrein inhibitor hatású polipeptid előállítására

3 159304 4 Az 1 181 859 számú NSZK közzétételi irat szerint a kationcserélőn történő megkötést és leoldást ismételve, a kapott termék sárgaszínű. A terápiásán alkalmazott termék minőségi követelményei szerint az oldatnak színtelennek kell lennie. Ezért a fenti eljárásokkal kapott •oldat további tisztításra szorul. Az 1 184 898 számú NSZK közzétételi irat szerint a kationcserélő karboximetilcellulózról koncentrált elektrolit-oldattal eluálnak. Az elektrolitot gélszűréssel távolítják el a polipeptid-oldatból. A találmány célja az ismert eljárások hátrányainak kiküszöbölésével olyan eljárás biztosítása, amely jó hozammal és könnyen megvalósítható módon teszi lehetővé terápiás alkalmazás céljára megfelelő tisztaságú és koncentrációjú kallikrein-inblbitor és tripszin-inhibitor hatású polipeptid előállítását. A találmány azon a felismerésen alapszik, hogy a tripszin-inhibitor és kallikrein-inhibitor hatású polipeptidet tartalmazó szervkivonat több lépésiben történő tisztítása után kapott, az aktív polipeptid melett viszonylag kevés szenynyező anyagot tartalmazó oldatból gyengén savanyú kationcserélő műgyantán vagy cellulózon megkötött hatóanyagot és a szintén megkötött szennyező anyagokat úgy különítjük el, • hogy a kationcserélő műgyantáról, illetve cellulózról a hatóanyagot specifikusan oldjuk le ásványi savat vagy erős szerves savat tartalmazó, 3 alatti pH-jú, 10—50 t/t% vízzel hígított, legfeljebb négy szénatomot tartalmazó alkohollal vagy ketonnal. A kísérő színes szenynyező anyagok ilyen körülmények között a kationcserélőn maradnak. Ez a felismerés azért meglepő, mert az eddigi tapasztalatok szerint a tripszin-inhibitor és kallikrein-inhibitor hatású polipeptidet kísérő szennyező sárga anyagok rövidszénláncú alkoholban vagy ketonban igen jól oldódnak. Ezért az volt várható, hogy ezek az oldószerek a kationcserélő gyantáról, illetve cellulózról a színes anyagokat is le fogják oldani. A találmány eljárás nagytisztaságú és töménységű kallikrein-inhibitor és tripszin-inhibitor hatású polipeptid előállítására tisztított állati szervkivonatból, a polipeptidnek semleges vagy gyengén bázisos közegből, gyengén savanyú kationcserélő műgyantán vagy cellulózon való megkötése, majd ásványi savat vagy erős szerves savat tartalmazó, 3 alatti pH-jú, poláris oldószerrel való leoldása útján. A találmány értelmében úgy járunk el, hogy a fenti módon megkötött polipeptidet a kationcserélő műgyantáról vagy cellulózról ásványi savat, célszerűen sósavat, kénsavat vagy foszforsavat, vagy erős szerves savat, célszerűen hangyasavat vagy ecetsavat tartalmazó, 3 alatti pH-jú, 10—50 t/tf/o vízzel hígított, legfeljebb négy szénatomot tartalmazó alkohollal, célszerűen metanollal vágy etanollal, vagy ketonnal, célszerűen acetonnal oldjuk le, majd további legfeljebb négy szénatomot tartalmazó alkohol, célszerűen metanol vagy etanol, vagy keton, célszerűen aceton hozzáadásával a hatóanyagot az oldatból kicsapjuk, és a csapadékot vízben 5 oldjuk. Az így kapott termék terápiás célra alkalmazható, nagy fajlagos aktivitású és töménységű, és színező szennyeződéseket nem tartalmaz. 10 A találmány szerinti eljárás előnyei közül megemlítjük, hogy lehetővé teszi a sárga és barna színű kísérő anyagoknak a hatóanyagtól való egyszerű elkülönítését. További előnye, hogy a tisztán vizes közegű leoldószerekiből 15 szükségesnél jóval kisebb térfogatú leoldószert, továbbá a kicsapásnál is a vizes közegű leoldás esetében használtnál jóval kisebb térfogatú szerves oldószert igényel. Azt is lehetővé teszi, hogy kiküszöböljük az oldat felhígulását ered-20 ményező anioncserélő alkalmazását, vagy az üzemi körülményék között nehezen megvalósítható gélszűrést. A kallikrein-inhibitor aktivitást (KIE) Werle — Kaufmann — Boetsch szerint [Hoppe — 25 Seyler's Z. f. physiol. Chem. 319, 52 (I960)], a tripszin-inhibitor aktivitás (TIE) pedig Anson szerint [J. Gen. Physiol. 22, 79 (1939)] mértük. A találmány szerinti eljárás foganatosítására az alábbi kiviteli példákat adjuk meg: 1. példa: Marhatüdőből kivont, tisztított kallikrein-in-35 hibitor és tripszin-inhibitor tartalmú, 1000 ml vizes oldathoz, amely 36 TIE és 9 00 000 KIE aktivitást tartalmaz 10 TIE/g fehérje tisztaságban, 50 ml 0,5 M pH 8-as nátriumfoszfát puffert, majd 150 ml Amberlte IRC 50 gyantát 40 adunk, amelyet előzőleg kiegyensúlyozunk 0,05 M pH 8-as foäszfätpufitferrel. 1 órán át kevertetjük az oldatot a gyantával, majd szűrjük, és az ioncserélő gyantát 3 x 1 liter vízzel átmossuk. A hatóanyagot az ioncserélőről 500 ml 0,1 45 N HCl-t tartalmazó 60 t/t%-os acetonnal oldjuk le 1 órán át való kevertetéssel, miközben, 1 N HCl-val a pH-t 2-re korrigáljuk. A gyanta szűrése után a leoldást 200 ml fenti oldószerrel megismételjük. Az egyesített eluátumökat 50 1 N NaOH-val pH 4-re állítjuk, majd 2100 ml acetoní adunk az oldathoz. A kicsapódott polipeptidet 16 órán át állni hagyjuk +5 —10 C°on, majd elkülönítjük és 500 ml vízben oldjuk. Az oldat 31 TIE és 7 700 000 KIE aktlivi-55 tást tartalmaz 19 TIE/g fehérje tisztaságban. 2. példa: 60 Marhapankreászból készült tisztított és fehér jementesített kallikrein-inhibitor és tripszin-inhibitor hatású polipeptid 200 ml vizes oldatához, amely 7 TIE és 180 000 KIE aktivitást tartalmaz 8 TIE/g fehérje tisztaságban, 10 ml 65 0,5 M pH 7-es nátriumfoszfát puffert adunk, .2