159093. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 6-amino-penicillánsav vizes oldatának aelőállítására

9 Jóval pH=8 felett a penicillin és a 6-APA bomlása elég nagy, és így jelentős veszteségek lépnek fel (több mint 20%-os /7-1 aktám bomlás). Az optimális hőmérsékleti érték kb. 35 és 45 °C között van. A legelőnyösebb hőmérséklet kb. 5 40 °C. 40 °C-nál jóval magasabb hőmérsékletek denaturálják az enzimet és így csökkentik a 6-APA termelést, mivel növelik a /J-laktámgyűrű bomlását. Így a reakció kb. 10 és 60 CC közötti hőmérsékleten mehet végbe. io Más, különböző vizsgálatokat is végeztünk, hogy meghatározzuk a reakció összes lényeges körülményét. Megállapítható, hogy 15% felesleg penicillin szubsztrát koncentráció nem emeli 15 lényegesen a 6-APA termelést. Bár a hidrolízis végrehajtható magasabb koncentrációkban, a legelőnyösebb koncentráció 7 és 10% között van. Kinetikusán a legjobb 6-APA termelési ér- 20 tekéket akkor kaptuk, ha a következő arányú összetevőket, illetve a következő körüményéket biztosítottuk: 1. 70—100 g/l penicillin V 25 2. 30 g/l benzhidrazid 3. Olyan Streptomyces lavendulae sejt/liter koncentráció, amelyet 600 ml térfogatú kultúrából az előbbiekben a „Penicillinamidáz előállítása" c. fejezetben, vagy az 1. példában le- 3

Q írt eljárással kapunk. 4. pH=7,5—8,5, előnyösen pH=8,0 érték 5. 35—45 °C közötti hőmérséklet. A hidrolízis egyensúlya (maximális 6-APA képződés) 2—24 óra, általában 2—6 óra alatt áll be. Az enzimes reakció befejezte után a nem rea- 40 gált penicillint, hidrazidot és a képződött acilhidirazid vegyületet szerves oldószeres, pl. butilacetátos, metil-izobutilketonos stb. extrakcióval eltávolítjuk, miután az anyalúgot pH=2—3 értékre savanyítottuk. 45 További tisztítás érhető el, ha a vizes oldatot semlegesítjük és a szennyezéseket oldószer, pl. aceton, metanol vagy etanol hozzáadásával kicsapjuk, majd az így kapott csapadékot lecentri- 50 fugáljuk. Az előző, vágy más koncentrációjú oldatot pH=6,5—7 értékre állítjuk be, és ioncserélő gyantán átengedve, a terméket adszorbeáljuk. Előnyös kloridciklusban működő, térhálósított polisztirol alapú, negyedrendű ammónium funkciós csoportokat tartalmazó, erősen bázikus anioncserélő gyantával, pl. a kereskedelemben „Dowex I" vagy „DeAcedite FF" néven forgalomba hozott gyantákkal töltött oszlopot használni. Használhatunk szulfonsav funkciós csoportokat tartalmazó, térhálósított polisztirol kationcserélő gyantát, pl. Amberlite IR 120-at is. Az adszorpciós lépésben 15 liter 40—16O g 6- 65 10 aminopenicillánsavat tartalmazó oldatra számítva előnyösen 4 kg gyantát használunk. A termék eluálása a gyantáról híg, pl. 0,05 N sósavval történik. 6-aminopenicillánsavnak vizes oldatokból történő kinyerésére szolgáló eljárást ismertet az 569 728 sz. belga szabadalmi leírás is. A találmány szerint vizes 6-aminopenicillánsav oldatok előállítására olyan eljárást alakítunk ki, melyet az jellemez, hogy egy természetes, előnyösen II általános képletű penicillint, mely képletben R 1—10 szénatomos alkilgyök, 3—10 szénatomos alkenilgyök vagy R1XCH2 csoport, melyben X kén- vagy oxigénatom, R1 2—6 szénatomos alkilgyök, 3—6 szénatomos alkenilgyök, fenilgyök vagy klór-, bróm-, jódfluoratommal, nitrocsoporttal, 1—6 szénatomos alkilgyökkel, 3—6 szénatomos alkenilgyökkel, vagy 1—6 szénatomot tartalmazó alkilgyököt tartalmazó alkoxi-csoporttal monoszubsztiíuált fenilgyök vagy annak sóit, illetve legelőnyösebben penicillin V-t vagy penicillin G-t és ezeknek sóit, 2—12%, előnyösen 4—12% koncentrációban, Streptomyces lavendulae A.T.C.C. 21138, Streptomyces lavendulae 13 664 és E. coli A.T.C.C. 11 105 ép vagy összezúzott sejttömegével vagy az ezekből keletkezett penicillinamidázzal, de előnyösen a Streptomyces lavendulae A.T.C.C. 21 138-cal inkubálunk; legalább 1% aktív hidrazid, előnyösen 1—4% hidrazid jelenlétében, az említett hidrazidot a fentiekben említett hidrazidok közül választva, és előnyösen aromás hidrazidot, főként benzhidrazidot alkalmazva, a reakcióelegy pH-ját 6—11,0 érték közé, előnyösen 6,5—9,0, leginkább 7,5—8,5 érték közé állítjuk be; a hőmérsékletet 10—60 °C, előnyösen 20—50 °C, de leginkább 35—45 °C hőmérsékleti intervallumon belül választjuk meg és a műveletet 2—34 óráiig, előnyösen 2—12 óráig, de leginkább 2-^6 órán keresztül végezzük. A további példák a találmány szerinti eljárás részletesebb ismertetését szolgálják, anélkül azonban, hogy az oltalmi igényt csak az ismertetett változatokra korlátoznánk. 1. példa Streptomyces lavendulae sejtek előállítása amidázos hidrolízishez. Fermentorban Streptomyces lavendulae 21 138-at inkubálunk a következő összetételű növesztő táptalajon: szacharóz 2,5% gyógyászati anyag (gyapotmagendosperm) (Archer—Daniel— Midland Co. gyártmánya) 1,5% kukoricalekvár 1>0% ammóniumszulfát 0,3% kalciumkarbonát 0,2% A tenyészetet 24—48 órán át növesztjük, majd ezt az egész levet alkalmazzuk a végső Streptomyces lavendulae fermentációs inokulumaként. S