159093. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 6-amino-penicillánsav vizes oldatának aelőállítására

5 J. Agr. Chem. Soc. Japan, 29, 400—407 (1955), Special Libraries Association, Translation Center, John Crerar Library, Chicago, Illinois. Lásd még referátumként C. A. 51, 8160g [1957]). A penicillinamidázok előállítása során Sakaguchi és Murao egyaránt a penicilliniparban széles körben használt Penicillium chrysogenum Q 176-ot faasználUa. [Lásd a „Separation and Identification of Penicillin Species in Commercial Penicillin (Q176 culture)" című előadást, melynek szerzője C. J. Salivar és munkatársai, és amely a washingtoni Conference on Antibiotic of Research-n (1947. január 31—február 1.) hangzott el, valamint a 2 479 296 és 2 562 407 sz. USA szabadalmi leírásokat.] Egy előnyös, a 3 014 845 sz. USA szabadalmi leírásban Streptomyces lavendulae törzsnek leírt és penicillinamidáz előállítására használt tenyészet az amerikai típusú tenyészetgyűjteményben (A.T.C.C, Washington, D.C.) A.T.C.C. 13 664-gyel van bejegyezve. Egy másik, A.T.C.C. 13 665 jelzéssel bejegyzett tenyészet általában kevesebb pigmentet termel, mint az A.T.C.C. 13 664 törzs és szintén felhasználható penicillinamidáz termelésre. A találmány szerinti eljárásban alkalmazott egyik legelőnyösebb tenyészet az A.T.C.C. 21 138 jelzésű törzs. Az organizmus a Streptomyces lavendulae-ként izolált anyatörzs egyik mutánsa. Hasonlóképpen fokozott 6-APA termelés jelentkezik, ha más, penicillinamidázt termelő mikroorganizmusfajta, így pl. Botrytis cinerea és Penicillium chrysogenum, valamint egyéb gombák, mint pl. Alternaria, Aspergillus, Epicoccum, Fusarium, Mucor, Penicillium, Phoma és Trichoderma nemzetség különböző egyedei által termelt penicillinamidázzal kombinálva valamilyen hidrazidöt is aUkalmazunk. A Criptococcus albidus és egy Trichosporon-hoz tartozó élesztő, valamint a Streptomyces család néhány Actinomyces-e penicillinamidázt termel. Ugyancsak termelésnövekedés észlelhető, ha Bacterium Proteus, Escherichia coli A.T.C.C. 9637, Escherichia coli A.T.C.C. 11105 és Aerobacter aerogenes törzseket alkalmazunk hidrazid jelenlétében. Penicillinamidáz állítható elő a Streptomyces család penicillinamidázt termelő mikroorganizmusaival a következő általános eljárással, amelyet az alábbiakban részletesebben leírt egyedi eljárás is szemléltet. A találmány szerinti eljáráshoz szükséges egy enzimkészítmény a következő általános eljárással nyerhető: A Streptomyces nemzetség egy penicillinamidázt termelő mikroorganizmusának spóráit tartalmazó táptalajról első átoltást végzünk agar táptalajra. Állás után megfelelő növekedés és spóraképződés jön létre, és ez az első generáció alkotja a második, ugyanezen a táptalajon fejlesztett generáció inokulumát. A megfelelő mértékben spórázott második generációt steril vízzel mossuk, és a keletkezett szuszpen-6 ziót aszeptikusán átoltjuk a táptalaji tartalmazó fermentorba. Mikor a fermentáció 24—28 órás, az egészet egy nagyobb fermentorba oltjuk át. 2—4 napos rázatás és levegőztetés után a raicéliumot leszűrjük, és így tiszta fermentlevet kapunk. Aszerint, hogy milyen mikroorganizmust használtunk, a penicillinamidáz Vagy a fermentlében, vagy a sejttömegben van. A találmány szerint választott organizmusban a kívánt penicillinamidáz az egész sejttömegben van és mint ilyen használható fel. A találmány szerinti eljárás során alkalmazott, penicillinamidázt tartalmazó Streptomyces lavendulae A.T.C.C. 21 132 sejtek előállítására szolgáló előnyös eljárás a következő: Penicillinamidáz előállítása Streptomyces A.T.C.C. 21 138-at tenyésztünk rázott lombikokban, 10 literes és 90 literes fermentorokban, 30 g/l-re hígított, 7,3—7,4 pH-értékű húsleves táptalajon. A táptalaj a következő összetételű: % glükóz-szörp 3.0 szójaliszt 2.5 élesztőextraktum (Difco) 0,5 nátriumklorid 0,5 kalciumkarbonát 0,2 Az első négy alkotórészt összekeverjük, a pH-t 35 6,8-re állítjuk be és hozzáadjuk a kalciumkarbonátot. Csírázási lépcsőt hozunk Jetre a mikroorganizmus fejlődésében, amely az adott láptalajon 30 órán át, kb. 27 °C-on, keverés köziben és levegőáramban történik, a penicillinfermen-40 tációhoz hasonlóan, és ennek a sejttömegnek 7 térfogatszázalékát használjuk fel a végső fermentáció inokulálásához. Ezt a végső fermentációt 96 óráig végezzük, 26—28°C-on, keverés és levegőztetés közben, majd a micéliumot leszűr-45 jük (vagy lecentrifugáljuk, tetszés szerint). Az összegyűjtött micéliumot mossuk és vizzel az eredeti táptalaj térfogatának kétszeresére szuszpendáljuk. A hidrolizálandó penicillint bizonyos mennyiségű hidraziddal a micélium szuszpenzió-50 jához adjuk. A hidrazidot általában a kiindulási penicillinkoncentrációval azonos nagyságrendben alkalmazzuk, előnyösen 0,5—A mól hidrazid/ /mól penicillin arányban. Az enzimes hasítás pH-értéke általában 6,0—11,0, előnyösen 6,5— 55 9,0. Az elegy hőmérsékletét 10—60°C-on, előnyösen 20—215 °C-on, leginkább 40 °C-on tartjuk. A 6-APA-tanmelésak, természetesen, az alkalmazott körülményektől függnek. Használha-60 tók ugyan az alábbiaknál rövidebb és hosszabb reakcióidők is, de a maximális termelések 2—24 óra, leginkább 2—6 óra alatt érhetők el. Egy lehetséges fermentációs táptalaj összetétele a kögg vetkező: 3