159029. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szubsztituált pirazol-származékok előállítására
159029 8 Az eredményeik arra mutattak, hogy a vizsgált vegyület mindegyik 'beviteli időpontban határozott védő hatást fajt ki. A kísérleti periódust az állatok 40—70%-<a élte túl, ha a kezeletlen kontroll mortalitását 100%-oaak tekintjük. A későbbiek során elhullott, de kezelt állatok túlélési periódusa a kontrolhoz képest körülbelül kétszeresére növekedett. A hatás tartósan fennállt, mivel nem figyeltünk meg jelentós különbségeket a vizsgált vegyület különböző időpontokban való bevitele esetén kapott eredmények között. Különböző koncentnációjiú 3H(4-jpiridil)-r4-(2-^hidroxiifénil^54zöpnapüpira:»lM (D. vegyület) végzett hasonló intranazáiMs vizsgálat — az anyagot szuszpenzióban, 30 perccel az aeroszolalakban Jap 305 inifluenza-Jvírussal való fertőzés előtt beadagolva — a következő erediméayeket szolgáltatta: 10 15 20 különböző humán rhinovíras-tápíusokkal szamben hatásos gátló koncentrációját a gradiens lemezHplakk^caokkentesi technikával határoztuk meg. HeLa ráksejt-tenyészeteket használtunk, amelyekből minden vizsgálathoz kettőt készítettünk. Az egyik tenyészetet a fenti vegyülettel kezeltük, amelyet gradiensben - alkalmaztunk, míg a másik tenyészet kontrollként szolgált. Ezután mindkét tenyészetet megfertőztük a humán típusú rhinovírussal. A gátló koncentrációt úgy határoztuk meg, hogy mentük a sejt-lemezen fellépő gátlása zónát. Hat rhinovírus-típust alkalmaztunk és az alábbi eredményeket kaptuk. Rhinovirus Típus Törzs Minimális Aktivitás gátló -f = 'aktív koncentráció — = in(jxgun/m!) aktív D. vegyület koncentráció Virus-Az Túlélés dózis, az adagok % LD50 száma H.N.A' T.I. szorzószáma 10 % 5 % 2,5% 60 30 40 13,0!0 9,76 1:0,00 1,<84 1,38 1,49 15 15 15 Vizsgálatokat végeztünk ezenkívül a 3-(4^piridil)-4-!(í2-(hidroxilfen!il)-i5^eti]|)irazol különböző típusú rhinovíriusokra kifejtett gátló hatása meghatározására. Mindegyik vizsgálat során két emberi emibriótüdő-tenyészetet készítettünk, amelyek közül az egyiket a fenti Vegyülettel kezeltük, míg a másik kontrollként szolgált. A tenyészeteket ezután iMnovíruíS-fiörzzaer fertőztük. A vegyületét 50 és 75 míkrograimm/ml konoentiiációlban alkalmaztuk és akikór tekintettük aktívnak, amikor a rhinovírus citopatogén hatása a kontroll tenyészetéhez képest legalább 75%-kál csökkent. A citopatogén hatást úgy határoztuk meg, hogy megszámláltuk az elroncsolt sejtek által alkotott plakkofeat (tarfoltokat). Hét humán rhinovírus-típust alkalmaztunk és a következő eredményeiket kaptuk: Rhinovirus Aktivitás típus törzs >(+ = aktív) 3 prototípus + " 5 prototípus + 6 SEH349 + 7 SFÍ1470 + 8 prototípus + 9 prototípus + 14 prototípus + 25 30 35 40 45 50 55 60 14 27 39 44 50 55 105i9 CocM 209 F01 3744 A2 íNo. Í58 Wis 3Ü5E 30 15—16 caJ'6 30 ca,2!5 20 + + További kísérletsorozatot végeztünk, amelyben a 3-i(4-'piridil)^4-(2-ihidroxiifenil)-5-etilpirazol A DNiA-csoportba tartozó vírusokkal kapcsolatban szövettenyészetben végeztünk vizsgálatokat a 3-)(1 4-piridil)-'4-ip-ih l idroxifenil)-5-etilpirazol Herpes Simplex-szél szembeni aktivitásának meghatározására. Az alkalmazott vizsgálati anyag nyúlvese-szövet volt. Egy olyan kísérletben; amely a vírusnak a vegyülettel való előkezelését foglalta magában, a vegyület és a vírus azonos térfogatú mennyiségét kémcsövekben 1 órán át szóbahőmérsékleten együtt inkubáltuk. A keveréket ezután bevittük a nyúlvese^szövetet tartalmazó palackba. A palackot 36 C°-on 2 órán át inkubáltuki majd .a folyadékot elöntöttük és 5 ml felső réteget adagoltunk. 4 nap múlva eltávolítottuk a felső réteget és 5 percen át kristályibolyával festettük. A plakkok kék háttérben tiszta területként jelentek -meg. 50%-os plakk-csökkentest jelentősnek tekintettünk. Ugyanezt az eljárást követtük egy második kísérletben azzal a különbséggel, hogy a nyúlvese-szövetet először megfertőztük és a vegyületet a felső rétegbe vittük be. Azt találtuk, hogy 250 pg-os adag ßO^/o-os plaikk-csűkkenést eredményezett az első vizsgálatban és 100%-os plakk-csökkenést a második vizsgálatban. " Ugyanezzel a vegyülettel egy másik vizsgálatot végeztünk a nyúl-szemben Herpes által indukált koratitisz-szel szembeni hatás értékelésére. A vegyületet helyileg 2,il és 0,5% koncentrációban alkalmaztuk és azt találtuk, hogy a vegyület mindhárom dózis-szinten gátolta földrajzi eredetű keratitiszes károsodások kialakulását a fertőzött' kontroli-állatokkal összehasonlítva. • Előzetes biológiai vizsgálatok arra mutattak, hogy az I. képlet által meghatározott körbe eső 4
