158336. lajstromszámú szabadalom • Eljárás (-) (cisz-1,2-epoxipropil)-foszfonsav előállítására mikrobiológiai úton

158336 71 72 A tápoldat pH értékét 6,5-re állítottuk be, és 0,5% Poliglikol 2000 szert adtunk hozzá. A beoltott lombikokat 2-8 C°-on 4 napon át inkubáltuk körrázóberendezésben, azután a levek et egyesítettük, megszűrtük és hatóanyagvizsgálat alá vetettük. A szűrt lé pH értéke 9,3 volt, és 1 : 8 arányú hígításban a Proteus vulgaris-szal végzett standard hatóanyagvizsgálat során 25 mm átmérőjű inhibiciós zónát adott. 24. példa:' A Streptomyces wedmorensis MA—3269 (NRRL—3426) liofilezett kultúrájával beoltottuk egy 250 ml-es terelőlapos Erlenmeyer-lombikban a 19. példában megadott összetételű steril élesztőkivonatos-glükózos tápoldat 50 mles részletét. Ezt a vegetatív oltóanyagot 28 C°~ on három napig inkubáltuk egy, percenként 220 fordulatszámú forgó rázóberendezésben. A kapott oltóanyaggal beoltottuk egy-egy 250 ml-es terelőlapos Erlenmeyer-lombikban a 20. példában megadott összetételű steril kazeinhidrolizátumos4iúskivonatos tápoldat 50 ml-es részleteit. Lombikonként 1,5 ml (3%) oltóanyagot alkalmaztunk. A beoltott lombikokat 28 C°-on négy napon át inkubáltuk egy, 220 percenkénti fordulatszámú forgó rázóberendezésben. A kapott lét centrifugáltuk és a tisztult lét a 7 mm-es papírkorongos standard hatóanyagtartalmi vizsgálat alá vetettük. Proteus vulgaris MB—838 mikroorganizmus segítségével. A lé 25 mm átmérőjű inhibiciós- övezetet mutatott. E lé további hatóanyagtartalom vizsgálatait ugyanezzel a korongos agardif fúziós eljárással 25 C°-on és 37 C°-on végeztük. 20 órás megfigyelési időtartam után az inhibiciós övezetek átmérője 7 mm (a korong átmérője), ill. 26 mm volt. A két megfigyelt hőmérsékleten az inhibiciós övezetek átmérőjében mutatkozó különbség jellemző a (—) (cisz-l,2-epoxipropil)-foszfonsav aktivitására. A tisztított tápoldat papírcsík-kromatográfiás mozgékonyságát az 1. példában leírt eljárásokkal vizsgáltuk; Proteus vulgaris MB—838-t alkalmaztunk vizsgálati biográfiás mikroorganizmusként. A ,,K" oldószerrendszerben ä tápoldat Rf értéke 0,25, a „C" oldószerrendszerben pedig 0,75 volt. 25. példa: 250 ml-es Erlenmeyer-lombikban a 19. példában megadott összetételű tápoldat 50 ml-es részletéhez 1 ml olyan oltóanyagot adagoltunk, amelyet úgy készítettünk, hogy ugyanannak a tápoldatnak 10 ml-es részletében szuszpendáltuk a Streptomyces wedmorensis MA—3269 (NRRL 3426) ferde-agaros kultúráját. A beoltott lombikot 28 C°-on két napig inkubáltuk. A kapott lével beoltottuk 250 ml-es Erlenmeyerlombikokban a 20. példában megadott összetételű steril kazeinhidrolizátumos-húskivonatos tápoldat 50 ml-es részleteit, lombikonként 2% oltóanyagot alkalmazva. A beoltott lombikokat 28 C°-on négy napig inkubáltuk percenként 220 fordulatszámú rázóberendezésben. 3 és 4 napi inkubálás után a .centrifugált lét a Proteus vulgaris MB—.838 segítségével a standard korongos hatóanyagvizsgálati eljárás alá vetettük, és megállapítottuk, hogy hatóanyagtartalma 6,2, ill. 6,8 egységnyi (—) (cisz^l,2-epoxipropil)-foszfonsav aktivitásnak felel meg. 26. példa: Streptomyces wedmorensist inkubáltunk a 25. példában leírt élesztőkivonatos-glükózos tápoldatban. Az így készült oltóanyag 2%-os adagjaival beoltottunk 250 ml-es Erlenmeyer-lombikokat, amelyekben 2% paradicsompürét és 2% előre megfőzött zablisztet tartalmazó steril vizes tápoldat 50 ml-es részleteit helyeztük el. Az így előkészített lombikokat 28 C°-on négy napig inkubáltuk percenként 220 fordulatszámú rázóberendezésben. A fermentált és centrifugált lének 3, ill. 4 napos inkubálás után a Proteus vulgaris MB—838-cal végzett standard korongos eljárással végzett- hatóanyagvizsgálata szerint e levek'3,7, ill. 3,5 egységnyi (—) (cisz-l,2-epoxipropil)-foszfonsav aktivitásúak. A tisztított lé további hatóanyagvizsgálata során 25 C°-on, ill. 37 C°-on 7 mm átmérőjű (a 7 mm-es korongok mérete), ill. 37 mm átmérőjű inhibiciós zónák mutatkoztak. 27. példa: 5,1 g (-)-) fenetilamin (—) (1,2-epoxipropil)foszfonátnak 15 ml vízben készült oldatát átbocsátottuk egy 81 ml hidrogén alakú, erősen savas polisztirol típusú kationcserélő műgyantával töltött oszlopon (Dowex 50x4), és az oszlopot vízzel előhívtuk. Egy előfrákció után a (—) (l,2-epoxipropil)-foszfonsav kezdett megjelenni az eluátumban. Ezt a pH értéknek kb. 1 alá való esése jelezte. Az ezután következő 40 ml-nyi eluátumot azonnal megfagyasztottuk és 25 mikron nyomáson liofileztük. A maradék kristályos (—) (cisz^l^-epoxipropil^foszfonsavból állott, amely azonnal megolvadt kb. 94 C° fölötti hőmérsékleten, ha erre a hőfokra vagy ennél magasabbra előmelegített olajfürdőbe helyeztük. Ha viszont az olvadáspontot úgy határozzuk meg, hogy a mintát szobahőfokról kezdjük felmelegíteni — még akkor is, ha percenként 60°-os hevítési sebességgel végezzük a meghatározást —, még 170 C°-on sem mutatkozik olvadás. A kristályos termék 2,15 C°-on a következő forgatóképességet mutatta: 578 mainál —8,7°; 546 m/i-nál —7,84°; 436 m,«-nál —12,6° és 405 m/x-nál —16,1°. 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 36