158336. lajstromszámú szabadalom • Eljárás (-) (cisz-1,2-epoxipropil)-foszfonsav előállítására mikrobiológiai úton
158336 55 * A túlélési idő meghosszabbodása (prolongáció) p = 0,025. ** Penicillinnel szemben rezisztens. 7. példa: A Streptomyces fradiae MA—2898 (ATCC 21096) vegetatív kultúrájának 500 ml-es részletével, amelyet úgy készítettünk, hogy a mikroorganizmust egy kétliteres terelőlapos Erlenmeyer-lombikban a 6. példában leírt módon tenyésztettük, beoltottunk egy 760 l-es rozsdamentes acél fermentálótartályt, amelyben 467 liter, alábbi összetételű steril tápoldat volt: 5ff Élesztőkivonat Glükóz MgS04 -7 H 2 0 Foszfátpuffer* Desztillált víz 10 g/liter 10 g/liter 0,05 g/liter 2 ml az előírt térfogatig * 91 g KH2 P0 4 és 95,0 g Na 2 HP0 4 desztillált vízzel 1 literre oldva. A beoltott tápoldatot 28 C°-on 24 óra hoszszat inkubáltuk gépi rázás mellett, miközben a fermentációs tápoldaton percenként 283 liter levegőt áramoltattunk át. A habzás csökkentésére kis mennyiségű Poliglikol 2000 szert is adagoltunk. A kapott fermentációs tápoldat 215 literes részletével beoltottunk azután egy 5700 l-es rozsdamentes acél fermentálótartályt, amely az alábbi összetételű steril tápoldat 4500 1 részletét tartalmazta: Zabpehely Szeszgyári cefre Szójaliszt Nátriumcitrát Nátrium aszkorbát Desztillált víz 20 g/liter 10 g/liter 20 g/liter 2 g/liter 0,5 g/liter az előírt térfogatig A tápoldatot sterilezés előtt 6,5 pH értékre állítottuk be. A beoltott tápoldatot 28 C°-on rázógépen inkubáltuk 2 napon át, miközben percenként 1560 1 levegőt áramoltattunk keresztül. Csekély mennyiségi Poliglikol 2000 szer adagolásával csökkentettük a habzást. Az így kapott fermentációs tápoldatot kovaföldön átszűrtük. A szűrt tápoldat 1900 1 részletét, amelynek aktivitása ml-enként 0,34 egység volt, az előzőleg használt anioncserélő műgyanta oszlopon bocsátottuk át, amely sztiroldivinilbenzol mátrixon levő kvaterner ammónium típusú (Dowex 1 x 2) volt, klorid alakban. A kapott műgyanta adszorbátumot 3%-os vizes nátriumklorid oldattal eluáltuk, és a kapott eluátumot 19 1 frakciónként gyűjtöttük. Proteus vulgaris-szal végzett hatóanyagtartalom-vizsgálat szerint az elhasznált tápoldat az oszlopból való kilépés után már inaktív volt. Az 5—12. frakciókat, amelyek a legnagyobb antibiotikus aktivitást mutatták, egymással egyesítettük. A. szűrt fermentációs tápoldat egy másik 2070 l-es részletét a fent leírttal azonos típusú friss 5 anioncserélő műgyanta 150 l-es adagjával töltött oszlopon bocsátottuk át. A kapott műgyanta adszorbátumot 3%-os vizes nátriumklorid oldattal eluáltuk és az eluátumot 19 l-es frakciónként gyűjtöttük össze. A 2—Hl. frakciókat, amelyek 10 a legnagyobb antibiotikus aktivitást mutatták, egyesítettük az első kromatográfia 5^12,. frakcióival, és az elegyet csökkentett nyomáson kb. 26 1 térfogatra pároltuk be. A kapott sűrítmény pH értéke 8,5 volt, hatékonysága pedig a fen-15 tebb leírt standard Proteus vulgaris eljárással meghatározva, 0,2 egység/ml. Ezt a műgyanta adszorbátum sűrítményt egy módosított vizsgálati eljárással is tanulmányoz-20 tuk, amelyben ugyancsak Proteus vulgaris volt a vizsgálati mikroorganizmus. E módosított vizsgálati eljárás szerint 5 ml beoltott tápoldatot használunk Petri csészében, és a vizsgálandó antibiotikumot 12 mm átmérőjű papírkorongra 25 helyezzük. A próbakorongokat tartalmazó csészét azután 37 C°-on 18 óra hosszat inkubáljuk, és mérjük a képződő gátlási övezetek átmérőjét. A hatékonyságot értékszámmal fejezzük ki, amely azt a ml-enkénti szárazanyag-mennyisé-30 get mutatja, amennyi az adott körülmények között 25 mm átmérőjű gátlási zónát hoz létre. A kapott 25,85 liternyi műgyanta eluátum 10.4 kg szárazanyagot tartalmazott és 2,7 mg/ml koncentrációban hozott létre 25 mm átmérőjű gát-35 lási zónát. Ehhez a 25,85 liternyi eluátumsűrítményhez 15 kg, savval mosott timföldet adtunk, és a keveréket 5,7 pH értéken 30 percig kevertük, 40 azután szűrtük. A szűredék szárazanyag tartalma 9,5 kg volt, és a fent leírt módosított vizsgálati módszerrel vizsgálva, 6,1 mg/ml koncentrációban hozott létre 25 mm átmérőjű gátlási zónát. A timföldön adszorbeálódott 833A 45 antibiotikumot 25 liter vízzel eluáltuk; a timföldes zagyot koncentrált ammóniumhidroxid adagolásával 11,1 pH értékre állítottuk be. 40 perces keverés után leszűrtük a timföldet, és a kapott eluátumot csökkentett nyomáson egy 50 liter térfogatra pároltuk be. E sűrítmény 361' g szilárd anyagot tartalmazott és 0,17 mg/ml koncentrációban 25 mm átmérőjű gátlási zónát adott. E dús sűrítmény 850 ml-es részletéhez 7650 ml 55 metanolt adtunk és az oldhatatlan részt szűréssel eltávolítottuk. A szűredéket, amelyl gyakorlatilag az antibiotikum egész mennyiségét tartalmazta, egy •— 1 kg savval mosott — timföldet tartalmazó oszlopon bocsátottuk át. A 60 timföld-adszorbátumot előbb fokozatosan 75%os, 50%~os és 25%-os metanolban oldott 2 n ammóniával, majd 2 n vizes ammóniával eluáltuk. Mindegyik metanolkoncentrációból egyenként 4000 ml térfogatot, valamint a vizes am-65 móniából is ugyanezt a térfogatot használtuk 28
