158174. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a 19 042 RP enziminhibitor és összetevői előállítására
158174 15 16 3. példa: A 2. példáiban leint körülmények között kapott és 115 E/mg titerű 200 g nyersterméket 2 liter desztillált vízben szuszpendálunk. A szuszpenziót szobahőmérsékleten 1 óra hosszat keverjük, majd papíron átszűrjük. A szűrt oldathoz lassan, keverés közben hozzáadjuk pikrinsavnak 0,1 n nátronlúggal készült telített oldatát az oldattal iazonos térfogatnyi mennyiségiben. A képződött oldhatatlan pikrátat zsugorított üvegszűrőn átszűrjük, majd bőséges desztillált vízzel mossuk. Ezután 3 : 7 térfogatarányú 3 n sósav-vízmentes etanol elegyben (300 ml) oldjuk. Ehhez az oldathoz áldandó keverés közben lassan 15 liter acetont adunk. Az így keletkezett csapadékot zsugorított üvegszűrőn átszűrjük,, aoetannial mossuk, majd 500 ml desztillált vízben oldjuk. Az oldiait Mofilizálíása után 4,45 g 19 042 RP-t kapunk 1335 E/mg titerrel. 4. példa: A 3. példában leírt körülmények között készült és 1415 E/mg titerű 6,5 g terméket 100 ml n/100 sósavban szuszpendálunk. Az inaktív oldhatatlan részt kiszűrjük. A szűrt oldatot „Biogel P 4" poliiakrilamidgélen kroimatogirafáljuk. Az oszlop 7,5 cm átmérőjű, és 0,5 kg „Biogel P 4"-et tartalmaz n/100 sósavban (ez megfelel 60 cm magasságnak). Az inhibitor-oldatot percenként 2,5 ml ütemben bocsátjuk át, az eluálást n/100 sósavval végezzük ugyanolyan ütemben. Az eluátumot 50 unices frakciókban fogjuk fel. A 280 nm-snél az ultraibolya sugarakat elnyelő frakciók antitripszin aktivitását meghatározva egyesíthetjük a 19 042 RP inhibitorban dús. frakciókat. Az 1—20. frakciók gyakorlatilag semmit nem tartalmaznak. A 21—44. és 54—80. frakciók ultraibolya sugarakat elnyelő inaktív termékeiket tartalmaznak. A 8000—40 000 E/ml aktivitású 45—53. frakciókat összegyűjtjük. Az oldatot liofilizálva 1,95 g 3480 E/mg titerű 19 042 RP inhibitort kapunk. 5. példa: A 4. példában leírt körülmények között kapott és 3430 E/mg táterű 8 g terméket feloldunk 60 ml desztillált vízben. Az oldatot alumíniumoxid oszlopon kromatografáljuk. Az oszlop átmérője 6 cm, és előzőleg desztillált vízzel hígított 4 pH-jú fcénsiawai kezelt 1 kg alumíniumoxidot tartalmaz. Ez megfelel 38 cm magasságnak. Az oldatot percenként 2 ml ütemben bocsátjuk át, majd desztillált vízzel eluálunk ugyanolyan ütemben. Az eluátumot kb. 50 ml-es frakciókban fogjuk fel. A 280 nm-nél az ultraibolya sugarakat elnyelő frakciók antitripszin aktivitását meghatározva egyesíthetjük a 19 042 RP inhibitorban dús frakciókat. A 0—16. és 21—40. frakciók ultraibolya sugarakat elnyelő inaktív termékeket 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 tartalmaznak. A 80 000—180 000 E/ml aktivitású 17—20. frakciókat összegyűjtjük. Az oldatot liofilizálva 3,35 g 6150 E/mg titerű 19 042 RP tiszta terméket kapunk, szulfátok és hidiroklo;ridok keveréke alakjában. Ez a termék szenet, hidrogént, oxigént, nitrogént, ként és klórt tartalmaz, és elemi összetételié a következő: C 50,0, H 7,0, O 17,5, N 20,5, S 2,0 és Cl 3,0%. Külső megjelenés: amorf halványsárga por. Ultraibolya . színkép (meghatározva 0,05%-os vizes oldatban); elnyelés 200 nm-jnél elnyelési minimum 243 nm-nél Ej' elnyelési maximum 257 nm-nél E J' v l0 '» "lem 1% 1% = 555, = 11, = 12,7, Infravörös színkép (meghatározva káliumlbromid tartalmú keverékből): az 1. ábrán látható; ezen az abszcisszán a felső skálán feltüntettüka hullámhosszakat mikronokban, az alsó skálán a hullámhosszakat cm"^1 egységekben, az ordinátán pedig az optikai sűrűséget. A 4. táblázatban közöljük a fontosabb infravörös elnyelési vonalakat. 4. táblázat 3350 ne 2750 v 3280 v 1730 v 3170 v 1670 e 2960 k 1645 ne és széles 2935 v 2870 gy 1550 e és széles 1495 v 1295 ngy 1465 k 1235 k 1450 k 1175 v 1445 v 1105 e 1390 k 1000 gy 1330 ngy 970 v 945 ngy 560 v 910 ngy 490 v 860 ngy 450 v 470 k 395 ngy 700 k 615 e ne = nagyon erős, e = erős, k = közepes, gy = gyenge, ngy = nagyon gyenge, v = váll. 6. példa: Az 5. példában leírt körülmények között készült és 5900 E/mg titerű 1,33 g terméket feloldunk 25 ml 18 tf%-os vizes etanolban. Az oldatot „Sephadex LH 20" dextrán oszlopon kromatografáljuk. Az oszlop átmérője 5,3 cm, ós 500 g 18%-os vizes etanollal duzzasztott dextrángélt tartalmaz (ez 65 cm magasságot jelent). Az oldatot óránként 65 ml ütemben bocsátjuk át az oszlopon, majd ugyanazzal a vizes alkohollal azonos sebességgel eluáljuk. Az. 8
