157738. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a glükózoxidáz fermentációs úton történő előállítására és tisztítására, továbbá kataláz előállítására
157738 5 6 teljesítményű sebességi fokozatot alkalmaztuk. A mícéliumsejtek feltáródása a mozgó gyöngyoszlop által kifejtett nyíróhatás következménye. A készülék feltáró hatását módunkban volt öszszehasonlítani más jól bevált laboratóriumi feltáró berendezésekkel a Londoni Egyetem Biokémiai Intézetében. Ügy találtuk, hogy a gyöngymalommal történt feltárás hatásfoka egyenértékű volt az egyik legjobbnak elismert, csak laboratóriumi méretben gyártott feltáró berendezés (a fagyasztott anyagot kis nyíláson, nagy nyomással átpréselő ún. „X—Press") hatásával és 30—50%-al jobb hatásfokúnak bizonyult az ultrahanggal működő feltáró, vagy más, nem fagyasztásssal kombinált, nyomással működő berendezéseknél. A készüléknek más feltáró berendezésekkel szemben előnye, hogy üzemi feldolgozásra alkalmas, könnyen kezelhető, folytonos működése révén munkateljesítménye nagy, feltáróhatása pedig kifogástalan. A micéliumszuszpenzió olyan gyorsan halad át a készüléken, hogy káros felmelegedés nem következhet be. Mivel a glükózoxidáz hőérzékeny enzim, a nyomással működő készülékeknél, valamint az ultrahanggal működő feltáró berendezésnél — nem fagyasztott anyag alkalmazása esetén — a micéliumszuszpenzió hőmérsékletének emelkedése s a hő hatására bekövetkezett inaktiválódása jelentős volt. A feltárás után a sejtmaradványokat tartalmazó szuszpenzióból a sejttörméléket szűréssel, vagy centrifugálással távolítjuk el. A tiszta szűrletből az enzimet oldószeres kicsapással kapjuk meg, vagy a szűrletet liofilizáljuk. Alkalmazott módszereink közül legjobbnak találtuk az izopropilalkoholos kicsapást (a vizes enzimszuszpenzió 2—3-szoros térfogatának megfelelő alkohol alkalmazását) és az enzimszuszpenzió liofilizálását. Liofilizálással nagyobb mennyiségű, de kisebb aktivitású (1500—2500 SE/g), oldószeres kicsapással pedig kisebb mennyiségű, de nagyobb aktivitású enzim nyerhető (8—11 000 SE/ g). A találmány szerinti eljárás további előnye a fenti táptalajok alkalmazása. A táptalaj lehet természetes vagy félszintetikus. A találmány szerinti eljárás során alkalmazott táptalajok az eljárást igen gazdaságossá teszik és a szintetikus táptalajokon elért eredményekkel összehasonlítva a glükózoxidázhozam lényegesen növekszik. A feltárás után a szűrletből kapott glükózoxidáz-enzim kísérőenzimekként katalázt és amilázt tartalmaz. A kataláz jelenléte az élelmiszeripari célra alkalmazott glükózoxidázban kimondottan előnyös, mivel a kataláz a glükózoxidáz aktivitását gátló hidrogénperoxid-reakcióterméket elbontja. A találmány szerinti eljárás előnye, hogy az élelmiszeripari célra előállított glükózoxidáz kataláztartalma nagyobb, mint az ismert eljárásokkal előállított enzimé. Analitikai célokra viszont tiszta, kísérőenzimektől mentes glükózoxidázra van szükség. E célból a glükózoxidázt tisztítjuk és egyúttal tiszta katalázt is előállítunk. A találmány szerinti eljárással az eddigi módszerekkel szemben — ahol többféle puffert alkalmaztak — már kétféle puffer használatával sikerült a glükózoxidázt a kísérőenzimektől mentesíteni. Az elválasztólapra felvitt glükózoxidáz oldat aktivitásának mintegy 70n /o-a eluálható kísérőenzimektől mentesen. A folyékony, tiszta preparátum az oldat bepárlásával állítható elő. A kísérőenzimeket tartalmazó frakcióból a katalázt az amiláztól elválasztjuk és ily módon tiszta katalázt állítunk elő. A leírásban és a példákban szereplő enzimegységek definíciója a következő: Sarette egység (SE) a glükózoxidáz aktivitási egysége. 1 Sarette egységnyi glükózoxidáz 3,3% glükózmonohidrátot tartalmazó 5,9 pH-értékű foszfát-pufferban, 30 C°-on, Wartburg manométerben mérve, percenként 10 mm3 oxigénfogyasztást okoz. Baker egység (BE) a kataláz aktivitási egysége. 1 Baker egységnyi kataláz a módszerben meghatározott viszgálati körülmények között 264 mg H2 0 2 -t bont le. Amiláz egység (E) 1 egységnyi amiláz 4,5 pH-értékű 0,05 mólos nátriumacetát-pufferban, 37 C°-on, egy óra alatt 10 mg keményítőt bont le. A találmány szerinti eljárás kiviteli módját közelebbről az alábbi példák szemléltetik. 1. példa: Fermentálás 10% melaszt, 2% kukoricalekvárt, 0,75% szuperfoszfátot és 0,55% ammóniumnitrátot tártai-, mázó természetes táptalajt 10% 24 órás Aspergillus riiger (1026/10/C2) tenyészettel beoltunk és 10 literes üvegfermentorban, 940 ford./perc keverés és 124 mniól 02 /Mter/óra levegőztetés mellett 28 C°-on 24 órán át fermentáljuk. A fermentléből a micéliumot leszűrjük és mossuk. A micélium glükózoxidáz összaktivitása literenként 1100 SE. Feltárás Több fermentorral dolgozva a fermentorokból kapott micélium egy mért aktivitású részét (70 865 SE) vízzel alaposan mossuk, centrifugáljuk és a vizes (12% szárazanyag tartalmú) micéliumot 1:4 arányban vízben szuszpenzáljuk, majd folytonos működésű gyöngymalomban 10 liter/óra sebességgel átszivatva feltárjuk s a feltárt micéliumot tartalmazó szuszpenzióból a sejtfal-maradványokat eltávolítjuk. A felülúszóban, az ún. extraháló lében levő glükózoxidáz összaktivitása 69 564 SE (a micéliumra 98,1%). 10 15 20 25 S0 35 40 45 50 55 60 3
