157611. lajstromszámú szabadalom • Eljárás reuma-szerű faktorok kimutatására alkalmas reagens előállítására

157611 3 csöves kísérletek titere ritkán haladja meg az 1:5000-es hígítást és ellentétben áll azokkal a titerekkel, amelyeket vagy csersavval kezelt és vörösvérsejtekkei érzékenyített, vagy érzékenyített latex-szel végeznek, ezek titere ugyanis 1:100 000 felett lehet. A Waaler—Rose féle birkasejt-vizsgálat elterjedését megbízhatósága ellenére korlátozza az, hogy a vörösvérsejtek hordozóanyaga instabilis. Emellett a vörösvérsejtek szabványosítása és érzékenyítése időtrabló művelet, ezt pedig gyakorta kell elvégezni. A találmány egyik célkitűzése stabilis, nyulgamma-globulinnal érzékenyített olyan nem, biológiai eredetű részecskékből álló anyag felkutatása, amely a reumaszerű faktorok érzékeny és specifikus reagenseként felhasználható. A találmány további célkitűzése kémcsöves kísérleteknél felhasználható kimutató vegyszer előállítása, amely a szűrővizsgálatoknál észlelt pozitív reakciók ellenőrzésére szolgálhat. A találmány célkitűzései közé tartozik az is, hogy a reagenssel a birka-vörösvérsejt-vizsgálatnál használt titerek utánozhatok legyenek. A reumaszerű faktorok meghatározását közönséges nyul-gamma-globulinnal megfelelő módon nem lehet végrehajtani. A kísérlet elvégzése szempontjából döntő jelentőségű, hogy a nyul-gamma-globulin antigén tulajdonságait megváltoztassuk. Ebből a célból a nyul-gamma-globulint enzimes kezelésnek vetjük alá. AE enzimmel kezelt nyul-gamma-globulinnal latexrészecskéket vonunk be. Az így érzékenyített latexes reagenst hőkezelésnek vetjük alá és így a nyül-gamma-globulin átalakulását teljessé tehetjük. A legcélszerűbbnek bizonyult az, ha a hőkezelést 7—10 napon keresztül 50 C°-on végezzük. Magasabb hőmérsékleten rövidebb melegítési idők is eredményesen alkalmazhatók. Ha azonban a latexes reagenst előzetes enzimes kezelés nélkül melegítjük, akkor megfelelő reagenst njem sikerül előállítani. A latex-rendszer előállítására 0,15—14 mikron, előnyösen azonban 8,81 mikron átlagos átmérőjű polisztirol részecskéket használunk. Akrilgyantából való anyagrészecskék is alkalmazhatók. < A nyul-gamma-globulin átalakítására számos enzimet vizsgáltunk és találtunk megfelelőnek. Ezek közül felsoroljuk a nyers és kristályos tripszint, kimotripszint és papaint. A gomba eredetű proteázok és a pepszin csak részben bizonyult hatásosnak. A nyul-gamma-globulin találmány szerinti átalakításának tudományos magyarázata még nem áll rendelkezésre, feltehetően arról van szó, hogy a nyul-globulin és a reumaszerű faktorok reakcióképessége attól függ, hogy hány szabad hely áll rendelkezésre a nyul-globulin -adszorpciója után a latex felületén. A globulin-molekulák proteolitikus enzimek segítségével történő lebontása megfelelő módszert biztosít ahhoz, hogy a latex-szerkezet döntően fontos helyei hozzáférhetővé válnak a reakció lefolyására. A lebontott anyag hőkezelésével a természetes anyag szerkezete tovább is lebontható és így a kívánt reakcióképes felületi helyek kialakulnak. A következő példák a reagens előállítását szemléltetik. 1. példa 100 mg nyul-gamma-globulint 5 ml 8,6 pH-értékű 0,1 mikron borát puff erben feloldunk. A globulint tartalmazó puffer-oldathoz a nyul-gamma-globulin súlyára számítva 1/10 menynyiségben nyers tripszint adagolunk, az oldat hőmérsékletét 37 C°-ra állítjuk be és 1 óra hoszszat ezen a hőmérsékleten tartjuk. Az enzimmel kezelt gamm.a-globulint ezután 50 ml 8,6 pH-értékű 0,1 mólos borát pufferrel/felhígítjuk és állandó keverés közben a fent készített oldatot 50 ml, 2 súlyszázalék polisztirol-részecskéket tartalmazó szuszpenzióhoz adagoljuk. Az alkalmazott polisztirol részecskék átlagos átmérője 0,81 mikron. Az elegyhez annyi Thiomersalt (etilmerkuritio-szalicilsavas nátriumsó) adunk, hogy ennék végkoncentrációja 1:5000 legyen. A kapott anyagot lassan 50 C°-ra felmelegítjük és 10 napon keresztül ezen a hőmérsékleten egy óra hosszat tartjuk. Stabilizálás céljából a véghígításhoz sómentes szarvasmarha-szérumalbuminit adunk 0,1% konoarntrációban és az elkészített anyagot +4 C°-on tároljuk. 2. példa 100 mg nyul-gammia-globulint 5 ml 8,6 pH-értékű 0,1 mólos borates pufferben feloldunk. A globulint tartalmazó puffer-oidaithoz a nyulgamma-globulin súlyára számítva Vio mennyiségben nyers tripszint adunk és az oldat hőmérsékletét 37 C°-ra állítjuk be és ezen a hőmérsékletan egy óra hosszat tartjuk. Az enzimmel kezelt gammia-globulint ezután 50 ml 8,6 pH-értékű 0,1 mólos borátos pufférrel felhígítjuk és állandó keverés köziben 50 ml 2 súlyszázalék polisztirol részecskéket tartalmazó szuszpenzióhoz adagoljuk. A szuszpendált polisztirol részecskék átlagos átmérője 0,81 mikron. A kapott anyagot Thiomersallal 1:5000 véghígításra állítjuk be. A hígított anyagot 93 C°-ra felmelegítjük és 10 percig ezen a hőmérsékleten tartjuk. A hőkezelt terméket -f 4 C°-on tároljuk. 3. példa 100 mg nyul-gamma-globulint 5 ml 7,1 pH-értékű 0,05 mólos foszfátos pufferben feloldunk. A globulint tartalmazó oldathoz a nyul-gamma-globulín súlyára számítva Vr-nyi mennyiségben papaint adagolunk, az oldat hőmérsékletét 37 C°-ra állítjuk be és 1 óra hosszat ezen a hőmérsékleten tartjuk. A kapott készítményt 8,6 pH-értékű borátos pufferral szemben dializáljuk, majd borátos pufferrel 50 ml-re felhígítj-uk és állandó keverés közben 50 ml 2 súlyszázalé-10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3! S