157501. lajstromszámú szabadalom • Eljárás citotetrinek előállítására

157501 í: 12 összetevője kimutatható. A rétegkromatográfiánál Kíeselgél-G rétegen végezve a kifejlesztést, az anyagokat narancsvörös színű foltok, illetve zónák alakjában észleljük, de ellenőrzésképpen Bacillus subtilis tesztorganizmussal bioautográ- 5 fiát is végeztünk. Mind a körpapírkromatográfiás, mind pedig a rétegkromatográfiás vizsgálatnál a citotétrin komplexben 8 színes összetevő mutatható ki, melyek közül az I-gyel és II-vel jelölt anyagok biológiailag hatástalannak bizo- 10 nyúltak. Az egyes összetevőket a kromatográfiás vizsgálatnál kialakult sorrend alapján A, B, C, D, E és F jelzéssel láttuk el. A két inaktív komponens fizikai és kémiai tulajdonságai nagymértékben hasonlítanak a citotétrin megfelelő tulaj- 15 donságaihoz. E színes komponensek feltételezhetően az aktív antibiotikum részleges lebomlása révén jönnek létre vagy az antibiotikum bioszintézisének közti termékei. Az eredményeket a 3-táblázatban szemléltetjük. 20 3. táblázat R/ Rendszerek l/a l./b ' l/e . 2/a 2/b Citotétrin A 45—50% Citotétrin B 12—16% Citotétrin C , 8—12% Citotétrin D 10—12% Citotétrin E 6— 8% 25 I. Inaktív 0,95 1,00 1,00 0,64 0,80 II. Inaktív 0,80 0,90 1,00 0,53 0,75 30 Citotétrin A 0,44 0,65 0,95 0,25 0,55 Citotétrin B 0,33 0,42 0,90 0,13 0,35 35 Citotétrin C 0,22 0,35 0,85 0,10 0,12 Citotétrin D 0,08 0,20 0,70 0,07 0,16 Citotétrin E 0,05 0,10 0,66 0,04 0,37 40 Citotétrin F 0,00 0,00 0,15 0,00 0,02 l/a pH 4,2 citrátpufferrel telített n-butanol 1/b pH 6,0 foszfátpufferrel telített n-butanol 45 l/c pH 8,0 foszfátpufferrel telített n-butanol 2/a n-butanol :ecetsav:víz 8:3:3 (Kieselgel-G réteg) 2/b n-butanol :ecetsav :víz 3:2:2 (Kieselgel-G-réteg) 50 A körpapírkrornatográfiát a megfelelő pufferral átnedvesített és két szűrőpapírlap között leszárított nedves papíron végezzük. A rétegkromatográfiás lemezeket két órán át 100°-on vég- 55 zett aktiválás után használjuk fel. Vizsgálataink alapján a citotétrin komplex átlagos összetétele a következő: 60 65 Citotétrin F kb. i»/0 I. inaktív 2— 4% II. inaktív 3- 5% A citotétrin A, B és C a leghatásosabb, míg a D, E és F komponensek hatása lényegesen alacsonyabb. A fenti módszerekkel kimutatott antibiotikus hatású komponensek szétválasztására kromatográfiás és ellenáramú megosztásos módszerek a legalkalmasabbak. Igen jó elválasztási módszer a különféle inaktív hordozókon, mint Celit, kovaföld, szüikagél stb. végzett megoszlásos kromatográfia. Celit 535 oszlopon kromatografálva, a kifejlesztést 4,25 pH-jú citrátpufferrel telített n-butanol :etilacetát 5:1 rendszerrel végezve, a citotétrin komplex valamennyi összetevője megfelelő tisztaságú állapotban előállítható. A kromatográfiánál az első frakciók a színes inaktív kísérőanyagokat (inaktív I. és II.) tartalmazzák, majd az egyes aktív komponensek az A, B, C, D, E sorrendben oldhatók le az oszlopról. Az F frakció, mely az oszlopon adszorbeálva marad, vizes metanollal oldható le. A körpapír- és rétegkromatográfiával ellenőrzött eluátumfrakciókat, melyek azonos komponenseket tartalmaznak, egyesítjük, és az egyes aktív komponenseket a citotétrin komplex kinyerésénél leírt extrákciós módszerrel nyerjük ki. Másik jól alkalmazható elválasztási módszer, melynek többszöri ismétlésével hasonlóképpen kromatográfiásan tiszta komponensek nyerhetők, a rázótölcsér-sorozatokban végzett ellenáramú megosztás. A citotétrin komplexet először nbutanol és 4,0 pH-jú citrátpuffer rendszerben osztjuk meg. Ezen az úton az inaktív pigmentek és az A, B, C komponensek elkülöníthetők a D, E és F komponensektől. Az A, B, C-tartalmú frakciót ezután n-butanol és pH 5-ös vizes puffer között megosztva elkülönítjük az inaktív pigmentektől, majd az így kapott frakcióból nbutanol: pH 5,5 puffer rendszerben végzett újabb 15-lépéses megosztással egy A komponensben dús, szennyezésként kevés B és elenyésző mennyiségű C komponenst tartalmazó, és egy A komponenssel szennyezett B és C elegyet kapunk. A citotétrin A-ban dús frakciót ezután n-butanol és pH 5,9-es foszfátpuffer között 10 lépésben megosztva, kromatográfiásan tiszta citotétrin A-t állíthatunk elő. A B és C komponenseket tartalmazó frakcióból n-butanol és 6,3 pH-jú puffer közötti megosztás segítségével, 25 lépésben a tiszta B és C komponensek nyerhetők. A, D, E és F komponenseket tartalmazó frakciókból a tiszta D és E komponensek n-butanol és 7,3 pH-jú foszfátpuffer közötti 30 lépéses megosztással nyerhetők ki. A citotétrin A narancsvörös színű amorf por, mely vizes metanolból átkristályosíthátó, és így élénk vörös színű, lemezes kristályokat kapunk. Olvadáspontja 212—214 C°. Oldhatósági viszonyai megegyeznek a citotétrin komplexével. Ultraibolya spektrumának jellemző adatai (3. ábra): 6