157483. lajstromszámú szabadalom • Eljárás urikáz előállítására

5 157483 6 stb. nitrogénje, 1^10 súly% koncentrációban jönnek tekintetbe; ásványi alkotókként foszfor, magnézium, kálium, nátrium, kalcium, vas 0,0001—0,5 súly% koncentrációban, anélkül azonban, hogy az ásványi alkotókat csäk a fent sorolt fémekre korlátoznánk, továbbá induktorként 0,01—0,2% húgysavat adagolunk. A fentiékben felsorolt elsődleges komponenseket oligodinamikus anyagokkal, mint aminosavakkal, vitaminokbal és növekedést élősegítő anyagokkal, nukleotidokkal, fém nyom-elemekkel, mint mangánnal, molibdénnel, rézzel, kobalttal és cinkkel egészíthetjük ki. Ilyen anyagok például természetüknél fogva az élesztőkivonatok vagy a protein hidrolízis termékei (állati vagy növényi), vagy a fémsók lehetnek, melyek 0,0001 —• 0,5% koncentrációban adagolhatok. A felsorolt előzetesen sterilizált különböző elemeket vagy a táptalaj elkészítésének pillanatában annak beoltása ellőtt, vagy a fermentáció során vihetjük be teljes mennyiségben, vagy részlegesen. Bizonyos anyagok azonban, különös jelentőségüknél fogva, az enzimszintézis fázisában vihetők be. Az említett elemek főleg, de nem kizárólagosan nitrogén vagy foszfor tartalmúak, továbbá a húgysav. A tenyésztés körülményei: A tenyésztést általában süllyesztetten végezzük keverés (rázás) és levegőztetés -segítségével. A keverés mértéke a berendezéstől függően 10 és 200 ford./perc között váltakozhat. A levegőztetés mértéke általánosságban 0,05 — 0,5 liter levegő percenként a közeg literenkénti menynyiségére számolva. Ugyancsak megfelelő keverést lehet biztosítani levegő átbuborékoltatásával is. Meg kell 'említeni, hogy a keverésnek és levegőztetésnek a mioélium. rendkívül gyors és intenzív kifejlődését biztosító körülményei általánosságban hátrányosak az enzim optimális termelésére. A táptalajt a tenyésztés egész ideje alatt 20 C° 'és 35 C° közötti hőmérsékleten, előnyösen 30 C° hőmérsékleten tartjük, a pH-t 4 és 8 közé, előnyösen 6,ö-ne állítjuk be, A tenyésztés időtartama: A tenyésztést előnyösen mindaddig folytatjuk, amíg az enzim-aktivitás optimális értéket ér el. Ezt az értéket mérés útján állapítjuk meg, melyet a továbbiakban a példák ismertetése után . írunk le. Ajánlatos' a fermentációt úgy vezetni, hogy az optimális enzimnaktivitás egy állandó aktivitási szintnek feleljen mieg és nem egy olyan, esetleg megnövelt aktivitásnak, mely csak átmeneti. A tenyészet általában maximális aktivitását 15 és 60 óra között éri el és ez az időtartam a táptalajtól, a törzsektől és a tenyésztés körülményeitől függően változik. Az enzim extrakciója: A fermentáció végén a tenyészetet szűrjük, hogy abból a micéliumot leválasszuk, ezt vízzel 5 mossuk, majd porítjuk, az urikáz kivonása érdekében. A találmány szerint a porítás elvégzése végett szárazjég vagy szénsavhó segítségével alacsony hőmérsékleten a micéliumot megfagyasztjuk. Elvégezhető ez a művelet bármely 10 egyéb eljiárás segítségével is, mely tehetővé teszi a micélium-'massza gyors és teljes koagulációját. Előnyösen —15 és —30 C° hőmérsékleten dolgozunk. A m'ioéliumot ezt követően olyan berendezésben porítjuk, amely a micélium-részek teljes 15 - szétbontását biztosít ja az enzim megváltozása nélkül. A porított terméket puffer tartalmú vagy ammonias víz segítségével újra felvesszük Jés a 20 szuszpenzió pH-ját 7—10 közé, előnyösen 8,5-re állítjuk be az enzim kivonása céljából. Ezt a műveletet 30 C° alatti hőmérsékleten végezzük, bármely megfelélő extralkciós eljárás alkalmazásával. Ezen túlmenően az extraktum stabilitásá-25 nak fokozására ahhoz komplexképzőt adagolhatunk 0,001 M koncéntráeiöban, így például etilénacetátot, diaminotetraecdtsavat, általában nátriumsó formájában. A szuszpenziót ezután szűrjük vagy szárítjuk. SO Az enzim 'tisztítása: A kapott micéliumkivonat tartalmazza az urikázt, tartalmaz azonban ezen kívül számos pro-35 teint ós egyéb alkotókat is oldat-formájában, vagy kolloidáliis állapotban. Szükséges lehet azok eltávolítása derítés útján olyan sók segítségével, amelyekkel komplexet alkotnak. Az alkalmazható derítőanyagok között elsősorban a kalciumsó-40 kat, mint pl. kalciumkloridot és az ólomsókat, mint pl. ólomiacetátokat említhetjük, melyek lehetővé teszik nagyszámú tisztátlanság nem oldódó vegyület formájában való kiküszöbölését. Egyébként, mivel maga az extraktum is igen jól 45 fermentálható közeg és ennek következtében könnyen átalakítható, adagolhattunk ahhoz antibiotikumot, mint klóramfenikolt vagy antiszeptikus szert, példaképpen nátriumazidot, 10 és 500 jucg/m\ közötti, előnyösen 100 //cg/ml 5« mennyiségben. Mivel az urikáz vízben oldható, szerves oldószerekben és ásványi sókkal, mint ammóniumszulfáttal telített vizes oldatokban azonban nem, könnyen visszanyerhető valamely az extraktum 55 térfogatára számított 0,5—3-szoros mennyiségű vízzel elegyedő szerves oldószer, mint pl. etanol, vagy izopropanol, előnyösen acetorenai való kicsapás útján, viay só hozzáadásával, főképpen a környezet hőmérsékletén telített ammónium-60 szulfát segítségével, amit az extraktum térfogatára számított 0,5—3-szoros mennyiségben alkalmazunk. Amennyiben kívánatos, a micélium-kivonatot me'gélőzően 40 C° .alatti hőmérsékleten csökken-65 tett nyomáson besűríthetjük. 3