157415. lajstromszámú szabadalom • Eljárás peptidek és azok származékainak szabályozott szintézisére
157415 47 48 31. példa: Bradykinin előállítása Az alábbi táblázat azt az eljárást szemlélteti, 5 amelynek segítségével az arginil-prolil-prolil-Hglicil-fenilaliaml-szerilipmlilHfienilalariil-arginin nonapaptidet a találmány szerinti eljárással előállítjuk. A táblázat sorrendben adja meg azokat a lépéseket, amelyek során N-karboxi-. 10 -anhldrideket vagy N-tiökariboxi-anihidrideket egymást követően adunk a reafccióelegyhez a kívánt termék nyerése céljaiból. A kezdeti reakció 1 millimól arginin és 1 15 millimól Nnkarboxi-ffenilalanin-ainhidrid között játszódik le bórsavval 10,,5-ös pH-ra puff er olt 10 ml vizes közegben. A reakcióelegy pH-ját 50%-os vizes nátriumhidroxid oldat hozzáadásával a reakció időtartama alatt ezen az értéken 20 tartjuk. A közbenső terimékként kapott prolil-íenilaianil-arginint a 3-as pH mellett végzett végső dekarboxilezést követően úgy különítjük el, 25 hogy először fagyasztva szárítjuk az elegyet, majd a maradékot metanolban felvesszük. A metanolt« oldatot szilifeagél-aszlopan kromatográfiaijuk, és a kívánt tripeptidet 20%-os vizes metanollal eluáljuk, ahol a metanol annyi ecetsavat tartalmaz, amennyi elegendő ahhoz, hogy a pH-t 5-(ös értéken tartsa. A tripeptidet további reakcióikkal alakítj ulk át a kívánt nonapeptididlé, a közibenső termakék elkülönítése nélkül. Az első reakcióban 1 millimól tripeptidet 5 millimól vízben ekvivalens mennyiségű N-tiokanboxi-szerin-anlhidriddel reagáltatunk, 9,0 pH-érták mellett, 4 €° hőmérsékleten, 30 perc reakcióidő alatt. A második reakció feltételeit a táblázatban soroljuk fel. A pH-t szilárd báriumhidroxiddal állítjuk be. A detiofcarboxilezést minden egyes reakció végén tömény kénsavival valósítjuk meg. A kicsapódó báriumszulfátot a további reakció folytatása előtt szűréssel eltávolítjuk. E reakeiósorozat végső terméke a bradikinin oldható szulfátjának oldata, amelyből a szalhad bázist előállítjuk, majd IRC 50 gyantán kromatográfiai úton különítjük el, vizes ecetsavval végzett fokozatos eluálás segítségével. . 1. táblázat Lépés Reagens Szubsztrátum Koncentráció pH Hőm. C° Idő 1 Phe NCA Arg. 1 mM/10 ml 10,5 0 1 perc 2 Rro NCA Phe-arg. 1 mM/10 ml 10,0 , 0 1 perc 3 Ser TCA * 1 mM/5 (ml 9,0 4 30 perc 4 Phe TCA * 1 mM/5 ml 9,5 25 1 óra 5 Gly TCA * 1 mM/5 ml 9,0 4 10 perc 6 Pro TCA * 1 mM/5 ml 9,0 25 30 perc 7 Pro TCA * 1 mM/5 ml 9,0 25 30 perc 8 Arg TCA * 1 mM/5 ml 9,5 25 1 óra * Szubsztrátum a korábban előállított peptid. 32. példa: Glicil-leucil-d:enilalanil^(C14 )-arginin elcíállítása 55 Ez ,a példa izotóppal jelzett peptid előállítását illusztrálja. 5,0 ml 0,01 n sósavban 0,392 mg egyenletesen jelzett C14 -arginint (0,5 imillicurie) és 20 ml 1 mólos fcáliumborát pulfiferben (pH = 10,5) 421 mg jelzetlen argiriint tartalmazó elegyet állítunk elő, amelyből 0,2 ml-es részt elveszünk. Az elegyhez 25—30 C° hőmérsékleten gyors keverés közben hozzáadunk egy részletben 5 mól% feleslegben INf^iofcarboxinfenilalanin-anhidridet, és a keverést 15 percen át folytatjuk, miközben a pH-t 5 n káliumhidroxid oldat hozzáadásával 10 és 10,5 között tartjuk. A reakcióidő végén ihabzásgátlóként egy csepp kaprilalbohiolt adunk a reakcióelegyhez. Ezután a, 60 pH-t tömény kénsav hozzáadásával 3,5-re állítjuk be és 10 percen át nitrogént vezetünk át az elegyen. Tömény káliumhidroxid oldattal a pH-t 10,2-re növeljük, majd a fenllalanlHC14 )-arginint tartalmazó reakicióelegyből 0,1 ml-es 65 részt elveszünk. 24
