157415. lajstromszámú szabadalom • Eljárás peptidek és azok származékainak szabályozott szintézisére

5 157415 6 nem kívánatos termékek képződnek. Azt találtuk, hogy az ilyen szabályozatlan reakciót vízben el lehet kerülni. Vizes közegek használata számos okból ideálisan alkalmas polipeptidek szabályozott lépcsőzetes szintéziséire. A fő ok az, hogy az aminosavak és a peptidek általában oldhatók vizes közegekben, de nem oldhatók szerves oldószerekben, minthogy ionos vegyületeket képeznek, és mert — peptid ek esetében — hidrofil amid-csoportokat tartalmaznak. Emellett a szerves oldószerek gyakran elősegítik a peptid-szintézis során a racemizálódást, és denaturálhatják a 'magasabb peptideket. Azt is érdemes megemlíteni, hogy a természetben talált peptidek és proteinek majdnem mindig vizes közegben vannak. Az NCA eljárás szabályozása vizes közegekben annyira nehéz, hogy sohasem kísérelték meg e módszer alkalmazását heteropeptidek lépcsőzetes szintézisére ilyen közegekben. A szabályozás nehézségét növelő fő tényezők a következők: (1) polimerizáció, (2) a reakció túlszaladása, (3) az NCA hidrolízise és (4) a felszabadult széndioxid által a reakcióra kifejtett zavaró hatás. A polimerizáció és reakció túlfutása a közbenső N-karboxi-vegyület idő előtti dekarboxileződésére vezethető vissza, aminek eredményeként a képződött termék az N-karboxi-anhidriddel végbemenő reakció szempontjából már versenyezni tud a kiválasztott 'kiindulási anyaggal. A kiindulási anhidrid hidrolízise hasonlóképpen a reakció tökéletlen lejátszódásához vezet annak következtében, hogy a kiindulási anhidrid nem áll rendelkezésre kellő mennyiségben. A közbenső termékek bármelyikéből felszabaduló széndioxid preferenciálisan reagálhat a kiindulási anyaggal és azt inaktiválhatja, aminők révén gátolj reakció teljes végfoemenatelét. Az NCA módszernek a lépcsőzetes szintézisre való adaptálásából származó egy további nehézség a szabályozás problémájának egy teljesen eltérő szempontjával, nevezetesen a tisztítással függ össze. Ha peptid-szintézis során nemi minden egyes lépést valósítunk meg úgy, hogy ellenőrizzük a polmi'erizációt, a reakció lefutását és a reakció megszaladását, a reakcióközeg nem kívánatos melléktermékekkel, többek között kisebb vagy nagyobb molekulasúlyú olyan termékekkel szennyeződik, amelyek csupán egy vagy két aminosavval különböznek a kívánt peptid-Jterméktől. Szennyeződések felléphetnék olyan peptidek keletkezése miatt is, amelyek azonos <molekulasúlyúak, azonban a kívánt peptid-terméktől eltérő szekvenciával rendelkeznek. Az ilyen melléktermékek fizikai és kémiai tulajdonságai annyira hasonlítanak a kívánt termékeihez, hogy elkülönítésük rendkívül nehézzé és gyakran lehetetlenné válik. Egyes szennyezéseket' természetesen el lehet tűrni, különösen azokat, amelyek a fizikai és kémiai tulajdonságok terén mutatkozó eltérések folytán könnyen elkülöníthetők a kívánt terméktől. Az oldhatatlan polimerek szűréssel könnyen eltávolíthatók. 5 A mostanáig kapott kedvezőtlen eredmények és az azokból levont kedvezőtlen következtetések ellenére azt találtuk, hogy az NCA módszert fel lehet használni peptid^szintézis egyszerű és gyors és szabályozott lépcsőzetes le-1° folytatására vízben, a közbenső pepiid-termékek elkülönítésével vagy e nélkül, polipeptidek, vagy Oxitocin, vazopresszin, angiotenzin vagy bradikinin és proteinszerű anyagok, így adrenokortikoitropin és inzulin előállítására. 15 Emellett a találmány olyan magasabb peptidek és proteinek, többek között enzimek és hormonok szintézisét is lehetővé teszi, amelyeket a mostanáig alkalmazott módszerékkel nem lehetett előállítani. 20 A találmány szerinti alapeljárás olyan peptidek és peptidszármazékok szabályozott szintézisére, amelyeik a peptid-láncban legalább két amid-kötéssel (rendelkeznek, abban áll, hogy 25 kiindulási anyagként egy amino-vegyületet, így aminosavat, peptidet vagy ezek szabad aminocsoportot tartalmazó származékait egy N-karboxi-aniinosavanhidriddel vagy annak származékával reagáltatjuk olyan módon, hogy a rea-S0 genseket vizes közegben érintkeztél] ük egymással olyan szabályozott körülmények között, hogy a reakció alatt reakcióképes alakban csupán a kívánt terméket kialakító aminosav, peptid vagy ezek származékának ami-35 no-csoportja van jelen számottevő koncentrációban, és egyéb amino-csoport, ideértve a képződött peptid-termék ammocsoportjait is, nincs így jelen. 40 A találmány szerinti, gondosan szabályozott körülmények mellett az. anhidrid és az aminosav, peptid vagy ezek származéka között a reakció szintézis bármelyik lépésében úgy megy végbe, hogy minimális mennyiségben 45 képződnek olyan melléktermékek, amelyek zavarnák az anhidrid következő reakcióját vagy a kívánt termék tisztítását. A szabályozott körülmények meggátolják, hogy a köztbenső N-karboxi vegyület dekarboxileződjön, vagy ha 50 dekarboxileződés végbemegy is, a szabaddá váló amino-csoport mindaddig védve van protonfelvétel útján, amíg lényegileg az összes kiindulási anyag le nem reagált az anhidriddel. Ennék a gondos szabályozásnak az az ered-55 menye, hogy a legnagyobb sebességű reakció szolgáltatja a kívánt terméket, és a' nem-kívánatos melléktermékek, különösen a reakció túlfutásából és a polimerizációból származó nem-kívánatos melléktermékek képződését 60 olyan határok között tarthatjuk, amelyek nem befolyásolják a szabályozott szintézis következő lépéseit. Az N-karboxi közbenső termék és a reagálatlan anhidrid elbontását követően az így képződött peptid-itermékat tovább reagál-65 tathatjuk egy másik anhidriddel hasonló reak-