157367. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gibberellinsav biztonságos termelésére
157367 6 (nem termelő) jelleg a sejtosztódás során túlsúlyba kerülhet. Találmányunk alapja az a felismerés, hogy nagy hozammal kapunk gibberellinsavat és a kitermelés is állandó értéken marad, ha aszexu- 5 ális moniliforme törzset alkalmazunk. A találmány értelmében a szexuális, ivaros szaporítósejtekét nem képező Fusarium moniliforme törzset úgy állítjuk elő, hogy kombinált io fizikai és kémiai mutagen kezelésnek vagy egyedül hősokk-kezelésnek vetjük alá. A kombinált fizikai mutagen kezelés egymást követő neutron-, Röntgen- és u.v.-besugárzás- 15 ból áll. Az alkalmazott neutrondózis 106—10 12 neutron (cm"') sec. fluxus, előnyösen 108 —10 10 neutron (cm-2 ) sec. fluxus vegyes neutronsugárral, a röntgenbesugárzás során alkalmazott diózis 50—300 kr, előnyösen 100—150 kr, az 20 u.v. besugárzás során alkalmazott diózis pedig 25—100 erg (mm2) sec. sr, előnyösen 50—80 er (mm2) sec. sr. Kémiai mutagen kezelésként a törzset ismert módon etilénnel, etilmetánszulfonáttal, dietil- 25 szulfáttal vagy N-mustárral kezeljük. Eljárhatunk úgy is, hogy fizikai és kémiai mutagen kezelés helyett csak hősokk-kezelést alkalmazunk. Ennek előnye, hogy a szelekciós 30 célt ezzel az eljárással gyorsabban elérjük, ugyanakkor a negatív termelő mutánsokk megjelenése ritkább. A találmány szerinti eljárás további előnyös foganatosítási módja abban áll, hogy a kombi- 35 nált fizikai és kémiai mutagen kezelésnek alávetett törzset kezeljük hősokkal. Ez a módszer kiválóan alkalmas a gibberellinsav termelés szempontjából káros protoplasztképző vonalak (valódi sejtfal nélküli micéliumot nem képző, 40 élesztőszerű szabad sejtek) kizárására. Előnyösen úgy járunk el, hogy az egymást követő neutron-, majd röntgenbesugárzás után szelekciót végzünk és a túlélők közül csak azo- 45 kat visszük tovább u.v. besugárzásra, amelyek megfelelő mennyiségű gibberellinsavat termelnek. Ezeket a mutagéneket kromotagráflás úton választjuk ki. A fenti kezelésekkel kapott aszexulális tör- 50 zset 1—8 % szénforrást és 1—4 % nitrogénforrást tartalmazó, táptalajon aerob körülmények között tenyésztjük, végül a gibberellinsavat a táptalajból ismert módon kinyerjük. Az oltáshoz felhasznált inokulum kora 96 óra és 144 óra 55 közé esik, mennyisége 1,5—2,0%. A fermentációt 1,0—1,5 liter levegő/liter táptalaj levegőztetés mellett végezzük. A találmány szerinti eljárás egyik előnyös fo- 60 ganatosítási módja abban áll, hogy szénforrásként búza-, rizs-, rozs-, árpa-, zab- vagy kukoricalisztet alkalmazunk. Előnyük, hogy az ipari sterilezés során nem károsodnak, könnyen beszerezhető olcsó szénforrások és stimuláló fak- 65 tort, pl. nélkülözhetetlen aminosavakat tartalmaznak. A találmány szerinti eljárás foganatosítására az alábbi kiviteli példákat adjuk meg. 1. példa: A Fusarium moniliforme G jelzésű törzset talajból (burgonyaföld) izoláltuk Czapek—Doxféle táptalajon. A törzs fenntartását maláta^agaroji végeztük. A Fusarium moniliforme G törzsből mikromanipulátorral monospórás tenyészetet állítottunk elő és ennek a tenyészetnek a szubkultúráit használtuk fel. Vegetatív micéliumból üveggyönggyel történő 10 perces rázatással koninidum szuszpenziót állítottunk elő. Ezután lemeziöntéseis eljárásai meghatároztuk a konidium szuszpenzió élő csíraszámát. A besugárzásihoz az előállított szuszpenziót 2 ml-es ampullákban 1 ml-ként sterilen lezártuk. Az ampullákba zárt szuszpenziót egymást követően vegyes neutronsugárral és röntgensugárral besugároztuk. Az alkalmazott neutrondiózis 1010 neutron/cm~ 2 /sec. fluxus, (az alkalmazott készülék a Központi Fizikai Kutató Intézet VVSZRM típusú szovjet vízmodeírátoros dúsított utón reaktora), a röntigenbesugárzás során (Medicor cég .Stabil : 250 típusú készüléke) alkalmazott diózis 100 kr. volt. Ezután a túlélőkeit megvizsgáltuk gibbeneJlinsav termelésre. Ezt úgy végeztük, hogy a törzsek légmicéliumát vagy mikirokonidium szuszpenzióját az alábbi összetételű táptalajra sűrű tenyészethez kikentük oly módon, hogy az egymás mellé húzott oltásnyomokból fejlődő telepek a szilárd táptalaj felszínéit az inkubáció után hézagmentesen borítsák: K2 HP0 4 0,5 g MgSC-4 0,5 g Fe2+ , Mn2+ , Zn 2+ , Cu2+ , B 2 + 10y/ml szárított élesztő 0,5 g kukoricaliszt 30 g malátakivoniat 40 g agar-agar 20 g csapvíz 1000 ml pH : 5,0 A táptalaj vastagsága a Petri csészében egyenletesen 3—-4 mm volt. Hét napon át 28 C-on végzett inkubáció után a tenyészeitekből csőmetszővel (belső átmérő 7 mm) blokkokat szúrtunk kii, majd azonnal a szárítóra tett bejelölt kromatográfiás papírra helyeztük őket. Az együtt futó sorozatokban a vizsgálandó blokkokkal párhuzamosan 1,25, 2,5, 5,0, 7,5 és 10,0 y gibberelisavat cseppen tettünk fel kontrollnak, valamint elhelyeztük a kontrolltörzs, azaz mutagen kezelésben nem részesült törzs sűrű tenyészetéből származó blokkját is. Az 3 •
