157295. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfát előállítására
157295 NAD és a NADP stabilitását és így a hozamot is. A találmány eljárás NADP előállítására enzimatikus úton NAD és ATP reagáltatásával. A találmány értelmében úgy járunk el, hogy a reakciót aprított nyers csirkemáj vizes extraktumából részleges hődenaturálás és betöményítés útján kapott enzimkészítmény jelenlétében, 5,5 és 8,0 közötti, célszerűen 6,5 és 6,8 közötti pH-tartományban, és adott esetben etilen-diaminntetraecetsav jelenlétében folytatjuk le. A találmány értelmében célszerűen úgy járunk el, hogy csirkemáj vizes extraktumából előáállított liofilizált enzimkészítményt feloldunk olyan reakcióelegyben, amely 100 mieniként 1—2 mM etiléndiamin-tetraecetsavat, 10—20 mM maginéziumkloridot, 40—SO mM NAD-t és 60-^120 mM ATP-t tartalmaz. A reaikcióelegyet 6,5 és 6,8 közötti pH-m 35—37 C° hőmérsékleten 2—3 napon át inkulbáljuk, maijd. a keletkezett NADP-t kromatográfiás eljárással frakcionáljuk, a NADP-t tartalmazó frakcióból a NADP-t kicsapjuk és szárítjuk. A találmány szerinti eljárás főbb előnyei a következők: a) Kitűnő (80—90%-os) kanverziót biztosít, szemben az eddig ismert eljárás 58,5%-os konverziójával. b) Jól reprodukálható, és lényegesen megbízhatóbb, mint az eddig ismert eljárás. c) Lehetővé teszi a nem-enzimatikus dinokleotid-bomlás minimális szintre redukálását. d) A szintézist katalizáló enzim-készítmény könnyen hozzáférhető csirkemájból olcsó eljárással állítható elő. A' találmány szerinti eljárás foganatosítására az alábbi kiviteli példákat adjuk meg. 1. példa: Csirkemáj vizes extraktumából előállított enzimkészítményfből (fajlagos aktivitás: 1,4 egység/mg) 500 mg-ot föloldunk 100 ml olyan oldatban, amelyben összesen 0,1 mmol EDTA (pro anal.), 1 mmol MgCl2 (pro anal.), 7,8 mmól NAD (Reanal) és 12,0 mimól ATP (Mycopharm) van feloldva. A reakcióelegyet 37 C°-os vízfürdőben inkubáljuk oly módon, hogy időközönként hozzáadott N NaOH-val az oldat pH-ját 6,5 és 6,8 között tartjuk. 48 órán át tartó inkubálás után az oldat 6,3 mmól NADP-Í: (81%) és 1,2 mmól NAD-t (15%) tartalmaz izocitrát^dehidrogenázzal, ill. élesztő alkohoidehidrogenázzal meghatározva (S. P. Colowick 5 és N. O. Kaplan, „Methods in Enzymology", Academic Press, New York, 1957, pp. »91—893). A reakcióelegyből a Wang és munkatársai által megadott [J. Biol. Ohem., 211. 465 01954.)] Dowex-^gyantás frakciomálással, ismételt ace-10 tonos kicsapással és szárítással tisztítjuk a NADP-Jt. A végső kitermelés 5,7 mmól NADP (90%^os tisztaságú készítmény). 15 30 35 40 45 50 2. példa: Mindenben az 1. példa szerinti módon járunk el, azzal az eltéréssel, hogy az 1 g enzimport (fajlagos aktivitás = 1,8 egység/mg), 1 mmól MgCVt, 8,4 mmól NAD-* és 13,5 mmól ATP-t 20 tartalmazó 100 ml reakcióelegy ipH-ját 5,'8-ra állítjuk be, és a reakció során 5,5 és 5,8 közötti értéken tarajuk. 76 órán át tartó inkubálás után az oldat 5,9 mmól NADP-t és 2,6 mmól NAD-t tartalmaz. A végső kitermelés 25 5,3 mmól 90%-os NADP-készítmény. 3. példa: Mindenben az 1. példa szerinti módon járunk el, azzal az eltéréssel, hogy a 400 mg enzimport (fajlagos • aktivitás = 1,18 egység/mg), 0,1 mmól EDTA-t, 1 mmól MgCl2 -t, 8,1 mmól NAD-t és 13,0 mmól ATP-t tartalmazó 100 ml reakicióelegy pH-ját 7,8-rá állítjuk be és a reakció során 7,8 és 7,5 közötti értéken tartjuk. 44 órán át tartó inkubálás után az oldat 6,i5 mmól NADP-t és 0,7 mmól NAD-t tartalmaz. A végső kitermelés 5,9 mmól 90%-os tisztaságú NADP-készítmény. Szabadalmi igénypont: Eljárás NADP előállítására enzimetikus úton NAD és ATP reagáltatásával, azzal jellemezve, hogy a reakciót aprított nyers csirkamáj vizes extraktumának részleges denaturálása és betöményítése útján kapott enzimkészítmény jelenlétében, 5,5 és 8,0 közötti, előnyösen 6,5 és 6,8 közötti pH-tartományhain, és adott esetben etilén-diamin-itetraacetát jelenlétében folytatjuk le. A kiadásért felel: a Közgazdasági és Jogi Könyvkiadó igazgatója. 7007877. Zrínyi (T) Nyomda, Budapest V., Balassi Bálint utca 21—23. 2
